野菊花藥效組分抗炎的生物效應(yīng)研究

鄭璐璐，張貴君，王晶娟，何瑞杰，崔秀梅

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102；2.中國藥材集團(tuán)公司，北京 101300）

野菊花藥效組分抗炎的生物效應(yīng)研究

鄭璐璐1，張貴君1，王晶娟1，何瑞杰1，崔秀梅2

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102；2.中國藥材集團(tuán)公司，北京 101300）

[目的]驗證和進(jìn)一步確定野菊花抗炎的藥效組分，為建立野菊花與臨床療效對應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。[方法]在高效液相色譜（HPLC）分析法確定初步藥效組分基礎(chǔ)上，采用小鼠血管通透性實驗和小鼠耳腫脹實驗驗證抗炎的生物效應(yīng),設(shè)立了野菊花水煎劑組、五味消毒飲組、模型組進(jìn)行比較。[結(jié)果]野菊花藥效組分組與模型組相比，有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01），與水煎劑組和五味消毒飲組相比，無顯著性差異（P>0.05）。[結(jié)論]野菊花的藥效組分（綠原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷和蒙花苷）確實具有抗炎作用，可以作為野菊花抗炎的藥效組分。

野菊花；抗炎藥效組分；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；生物效應(yīng)

野菊花功效清熱解毒，主治癰腫瘡毒、目赤腫痛、眩暈頭痛，是常用的一味中藥，但是由于一直缺少標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（藥效組分）[1]，給野菊花及其制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定帶來了一定的困難。本研究在中藥藥效組分理論的指導(dǎo)下，在由高效液相色譜（HPLC）分析法確定野菊花初步藥效組分基礎(chǔ)上[2-5]，通過現(xiàn)代藥理實驗結(jié)合療效確切的經(jīng)方最終確定了野菊花的抗炎藥效組分，為建立野菊花與臨床相對應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供新的研究思路與方法。

炎癥是臨床常見的一個病理過程，可以發(fā)生于機(jī)體各部位的組織和器官，炎癥前期主要表現(xiàn)為滲出液增多，后期則以結(jié)締組織增生常見。本研究選用小鼠血管通透性實驗及耳廓腫脹實驗，以地道產(chǎn)區(qū)安徽金寨的野菊花為研究載體，將藥效組分與水煎劑進(jìn)行對比實驗，并通過經(jīng)方和對經(jīng)方的加減對其進(jìn)行同步驗證，現(xiàn)將實驗結(jié)果報道如下。

1 實驗材料

1.1 動物 ICR小鼠（18～22）g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，合格證號：SCX K（京）2006-0009，將其在室溫22～25℃、相對濕度為65%的動物室中12h明暗交替照明3～4日，讓其自由進(jìn)食、飲水。

1.2 藥品與儀器 阿司匹林腸溶片：北京太洋藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號060102。0.9%氯化鈉注射液（250mL/瓶）：四川科倫藥業(yè)股份有限公司。伊文思藍(lán)（化學(xué)純、50 g/瓶）：上?；瘜W(xué)試劑公司，批號981016。冰醋酸、二甲苯（500mL/瓶）：北京化工廠。打孔器（直徑8mm），JN-B型精密扭力天平，日立U-3010紫外分析儀。

1.3 溶液配置 野菊花水煎液配置：12 g的安徽金寨野菊花，8倍量水煮2次，混合兩次濾液濃縮得到。五味消毒飲復(fù)方配置：金銀花15 g，野菊花6 g，蒲公英6 g，紫花地丁6 g，天葵6 g，8倍量水煮兩次，混合兩次濾液濃縮得到。五味消毒飲復(fù)方減去野菊花再加上藥效組分溶液的配置，以下簡稱“復(fù)減野加組分”組：金銀花15 g，蒲公英6 g，紫花地丁6 g，天葵6 g，8倍量水煮兩次，混合兩次濾液濃縮，再加入藥效組分（綠原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、蒙花苷）。藥效組分高劑量組的配置：按金寨產(chǎn)野菊花中各藥效組分所測含量，配制成每mL含綠原酸0.511mg、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷 0.157mg、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷0.146mg、蒙花苷1.179mg的溶液；藥效組分中劑量組是將高劑量組的濃度稀釋1倍；藥效組分低劑量組是將中劑量組的濃度稀釋1倍。

2 實驗方法

2.1 小鼠血管通透性實驗（急性滲出實驗）

2.1.1 分組與給藥 ICR小鼠90只（雌雄各半）隨機(jī)分為9組，每組10只。第1組為空白組(給等量蒸餾水)，第2組為模型組（給等量生理鹽水），第3組為陽性對照組[給阿司匹林溶液0.013 g/（kg·d）]，第4組為野菊花水煎液組[1.56 g/（kg·d）]，第5組為野菊花藥效組分低劑量組（0.4mL/d），第6組為野菊花藥效組分中劑量組（0.4 mL/d），第7組為野菊花藥效組分高劑量組（0.4 mL/d），第8組為五味消毒飲組[5.07 g/（kg·d）]，第9組為“復(fù)減野加組分”組[4.29 g/（kg·d）]，陽性阿司匹林組只在實驗最后一天給藥，其他組每天給藥1次，連續(xù)7 d。

2.1.2 測定指標(biāo) 末次給藥30min后除空白組外，各鼠均尾靜脈注射0.5%伊文斯藍(lán)生理鹽水溶液0.2mL，隨即腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2mL/20 g，20min后脫臼處死，腹腔注射5mL生理鹽水，輕揉小鼠腹部，以使腹腔內(nèi)染料充分溶于生理鹽水中并混合均勻，剪開腹部皮膚肌肉，用吸管吸取腹腔洗出液4mL，3 000 r/min離心15min；取上清液于608 nm處比色測定光密度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出每只小鼠腹腔滲入的伊文思蘭含量（g/L）[6]，該數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用SAS8.2統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,獨立樣本t檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.1.3 伊文思蘭溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將準(zhǔn)確配制的0.4987%伊文思藍(lán)溶液稀釋成 9.68、7.26、4.84、2.42、1.21mg/L等濃度的溶液，在590 nm處比色測定，根據(jù)OD值與濃度，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=0.022X+0.0379，r=0.9981。

2.2 小鼠耳緣腫脹實驗（慢性腫脹實驗）

2.2.1 分組與給藥 分組方法和給藥劑量同2.1.1。灌胃給藥，1次/d，連續(xù)7 d。

2.2.2 測定指標(biāo) 末次給藥后1 h，除空白組外，在每只小鼠左耳涂二甲苯50μL，右耳為對照，涂二甲苯45min后處死小鼠，沿耳廓線剪下左右耳，用直徑8mm的打孔器將雙耳同部位等面積切下，分別稱質(zhì)量，以左、右耳片質(zhì)量之差為腫脹度，計算抑制率[6]。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用 SAS8.2統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，正態(tài)分布資料的組間比較采用單因素方差分析，偏態(tài)分布資料組間比較采用秩和檢驗對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

3 結(jié)果

3.1 野菊花藥效組分對小鼠血管通透性的影響 實驗結(jié)果顯示：空白組小鼠的腹腔洗滌液顏色幾乎為透明，腹腔液滲出染料的OD值很小，模型組小鼠的腹腔洗滌液顏色為藍(lán)色，腹腔液滲出染料的OD值較大，且空白組與模型組腹腔液滲出染料的OD值相比，具有顯著性差異（P<0.01），證明造模成功。

各藥物組小鼠的腹腔洗滌液與模型組相比顏色淺，經(jīng)比色測定小鼠腹腔滲出染料量少且具有顯著性差異（P<0.05或P<0.01），則各受試藥物組均可明顯抑制H+所致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增加。藥效組分的低、中、高劑量組，五味消毒飲復(fù)方組及“復(fù)減野加組分”組，與水煎液組相比均無顯著性差異（P>0.05），則證明野菊花的藥效組分確實具有急性抗炎作用，其抗炎藥效組分為：綠原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷和蒙花苷。實驗數(shù)據(jù)見表1。

表1 對HAc所致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高的影響（±s,n＝10)Tab.1 Effecton capillary permeability increasing induced by HAC inm ice（±s,n＝10)

表1 對HAc所致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高的影響（±s,n＝10)Tab.1 Effecton capillary permeability increasing induced by HAC inm ice（±s,n＝10)

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

伊文思蘭含量（mg/L）空白組 0 0.96×10－2-1.286±0.021 0**模型組 0 16.42×10-2-5.741±0.024 0陽性組 0.013 3.92×10-2-0.059±0.024 0**水煎液組 1.560 13.09×10-2-4.227±0.184 4*藥效組分組 低 0.012 9 8.73×10-2-2.245±0.110 0**中 0.006 5 6.12×10-2-1.059±0.069 0**高 0.003 2 4.71×10-2-0.418±0.009 5**五味消毒飲水煎液 5.070 7.11×10-2-1.509±0.067 0**“復(fù)減野加組分”組 4.290 8.32×10-2-2.059±0.086 0**組別 劑量（g/kg）OD值（x）

3.2 野菊花藥效組分對小鼠耳廓二甲苯致炎的影響 實驗結(jié)果顯示：空白組與模型組相比，腫脹度差異顯著（P＜0.01），則證明造模成功。各組受試藥物與模型組相比，均有顯著性差異（P＜0.05或 P＜0.01），則證明各用藥組均可抑制小鼠耳廓腫脹。藥效組分組、五味消毒飲組和“復(fù)減野加組分”組與水煎劑組相比，無顯著性差異（P>0.05），證明藥效組分、復(fù)方組與水煎液組均可抑制二甲苯引起的腫脹，其中藥效組分中劑量組、高劑量組和“復(fù)減野加組分”組的腫脹抑制率較高。見表2。

4 討論

小鼠血管通透性和小鼠耳緣腫脹的動物模型是研究抗炎作用的經(jīng)典模型，本實驗中野菊花水煎劑、藥效組分及經(jīng)方五味消毒飲均能顯著抑制二甲苯所致小鼠耳廓腫脹，以及醋酸所造成的小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高。有研究表明野菊花具有抗菌消炎的作用[7]。本課題組研究得到的藥效組分與水煎劑相比，在抗炎方面均差異不顯著（P>0.05），并在經(jīng)方五味消毒飲中得到驗證。即：綠原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷和蒙花苷為野菊花的抗炎藥效組分。

表2 對小鼠耳廓二甲苯致炎的影響（±s,n＝10)Tab.2 Theeffecton xylene-induced inflammation of m iceears（±s,n＝10)

表2 對小鼠耳廓二甲苯致炎的影響（±s,n＝10)Tab.2 Theeffecton xylene-induced inflammation of m iceears（±s,n＝10)

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

抑制率（%）空白組 0 0.3±0.68** -8.3模型組 0 1.2±0.66 -陽性組 0.013 0.4±1.26** 66.67水煎液組 1.56 0.8±0.63** 33.33藥效組分組 低 0.0129 1.0±0.37* 16.67中 0.0065 0.8±0.14* 25高 0.0032 0.6±0.15** 50五味消毒飲水煎液 5.07 0.9±0.19 25“復(fù)減野加組分”組 4.29 0.7±0.20** 41.67組別 劑量（g/kg·d）腫脹度（mg）

本研究同時設(shè)立了空白組和模型組，以期通過空白和模型的比較證明造模的成功，而且在通過經(jīng)方進(jìn)行驗證時，將復(fù)方中的野菊花藥材換成野菊花藥效組分進(jìn)行驗證，進(jìn)一步證明了本實驗室所篩出的野菊花藥效組分確實與臨床療效有一定相關(guān)性。

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[2]吳明俠，張貴君.HPLC測定野菊花中兩種黃酮類藥效組分的含量[J].中國現(xiàn)代中藥，2008，10（2）：20-22.

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[4]吳明俠，張貴君.HPLC測定野菊花水提取液中有機(jī)酸類藥效組分的含量[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2008，2（12）：10－12.

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Biologicalanti-inflammatory effects in active com ponents of FlosChrysanthem i Indici

ZHENG Lu-lu,ZHANGGui-jun,WANG Jing-juan,etal
（Chinese Herb College,Beijing University of TCM,Beijing100102,China）

[Objective]To verify the active components of anti-inflammatory effectand provide the scientific basis date for the clinical curative effect of quality standards in Flos Chrysanthemi Indici.[Methods]On the basis of determining the active components of the classic prescription by HPLC analysis the biological anti-inflammatory effectswas demonstrated bymice vascular permeability test and auricle tumefaction test.The FlosChrysanthemi Indicidecoction group andWuweiXiaodu decoction groupwereestablished and compared with themodelgroup.[Results]Compared withmodelgroup,Flos Chrysanthemi Indiciactive components group had significant difference(P<0.05 or P<0.01).Therewasno significantdifference between Flos Chrysanthemi Indicidecoction group and the“WuweiXiaodu drinking” group(P>0.05).[Conclusion]The active componentsof Flos Chrysanthemi Indici(Chlorogenic acid,Luteolin-7-O-β-D-glucoside,Apigenin-7-O-β-D-glucoside and Buddleoside)really have obviouseffectsofanti-inflammation,so they are the active componentsof anti-inflammatory effectof Flos Chrysanthemi Indici.

FlosChrysanthemi Indici;active componentsofanti-inflammatory effect;quality standards;biologicaleffects

R284.2

A

1672-1519(2011)03-0251-03

鄭璐璐（1984-），女，碩士研究生，主要研究方向：中藥藥效組分及中藥藥效組分質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

張貴君。

2010-11-22）