菲律賓蛤仔糖蛋白提取及體外抗腫瘤活性研究

郁 迪，楊永芳，王加斌，楊最素，黃芳芳，鄭玉寅，李 榮，丁國(guó)芳*

（1.浙江海洋學(xué)院食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江舟山 316004；2.浙江海力生制藥有限公司，浙江舟山 316021）

菲律賓蛤仔Ruditapes philippinarum，屬軟體動(dòng)物門Mollusca、瓣鰓綱Lamellibranchia、簾蛤科Veneridae，山東稱蛤蜊，廣泛分布在我國(guó)南北海區(qū)。菲律賓蛤仔肉蛋白質(zhì)量較高，脂肪含量較低，且含維生素和微量元素豐富，是較好的海洋生物功能食品。最新研究結(jié)果表明，菲律賓蛤仔肉組織中的所含的活性物質(zhì)具有抗癌、改善癥狀、延長(zhǎng)病人生命、提高免疫力、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用[1-3]。糖蛋白廣泛存在于生物體內(nèi)，是蛋白質(zhì)和糖類的共價(jià)復(fù)合物，具有很多重要功能。它既是激素、凝集素、酶、毒素、病毒和細(xì)菌等的識(shí)別點(diǎn)，也是細(xì)胞表面抗原、糖分化抗原和癌發(fā)育抗原，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中具有十分重要的作用[4-6]，目前，從海洋生物中分離純化得到糖蛋白并研究其抗癌作用已有報(bào)道[7-9]。筆者經(jīng)離子交換和凝膠層析等方法分離純化得到具有較強(qiáng)活性的糖蛋白，并對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)及體外對(duì)人腫瘤細(xì)胞的增殖抑制活性進(jìn)行了初步研究,以期為菲律賓蛤仔的深度開發(fā)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

菲律賓蛤仔采于舟山活鮮市場(chǎng)，經(jīng)專家鑒定后，取其肉，立即冷藏于-20℃冰箱備用。DEAE SepharoseFF陰離子交換柱購(gòu)自于北京亞太恒信生物科技有限公司；MTT試劑盒、培養(yǎng)基和胰蛋白酶購(gòu)于sigma公司，二甲基亞砜購(gòu)于美國(guó)amresco公司；Sephadex G-25凝膠購(gòu)自上海如吉生物科技有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

采用HD-21-88蛋白檢測(cè)儀、BSZ-40-LCD自動(dòng)部分收集器、BSA124S型電子天平、DS-1型高速組織搗碎機(jī)、Nicolet is10紅外光譜儀、CF16RXII高速冷凍離心機(jī)；U2800型紫外可見分光光度計(jì)、ZHJHC1209C型超凈工作臺(tái)、Forma 3111型CO2培養(yǎng)箱、Olympus倒置顯微鏡、Bio-Rad酶標(biāo)儀等。

1.3 菲律賓蛤仔糖蛋白提取純化工藝

1.3.1 糖蛋白提取

將300 g蛤肉組織機(jī)械絞碎，然后加3倍體積蒸餾水，90℃水浴抽提4 h，2層紗布過濾。將殘?jiān)?倍體積蒸餾水，90℃水浴抽提3 h，兩層紗布過濾，合并2次濾液。3 000 r/min離心10 min，收集上清液。50℃減壓濃縮至800 mL，加入4倍體積無水乙醇，4℃靜置過夜。小心傾去上清液，收集沉淀。然后4℃下5 000 r/min離心10 min收集沉淀。將沉淀真空冷凍干燥，得粗提物。

1.3.2 粗提物的色譜分離純化

準(zhǔn)確稱取干燥物樣品4.3 g，室溫下加入200 mL去離子水溶解搖勻。取氯仿—正丁醇(體積比為4∶1)溶液40 mL加入溶液中，4℃靜置過夜。將上清液倒出，重復(fù)上述過程，共計(jì)2次。將上清液冷凍干燥，然后過DEAE SepharoseFF離子交換層析柱，NaCl溶液洗脫分3個(gè)濃度進(jìn)行，分別為：0.1、0.3和 0.5 mol/L，洗脫速度1 mL/min，每管4 mL進(jìn)行收集，紫外280 nm檢測(cè)蛋白峰，同時(shí)采用苯酚-硫酸法檢測(cè)糖峰，收集峰值洗脫液，用Sephadex G-25凝膠柱除鹽，冷凍干燥后備用。

1.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析

采用15%的SDS-PAGE電泳膠，考察純化后糖蛋白的電泳行為，用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行染色。

1.5 糖蛋白理化性質(zhì)分析

1.5.1 糖與蛋白含量測(cè)定

糖含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品；蛋白含量測(cè)定采用Folin-酚法，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.5.2 紫外和紅外光譜

紫外光譜掃描范圍為190～490 nm，檢測(cè)峰值所在波長(zhǎng)。紅外光譜采用溴化鉀壓片法，在400～4000 cm-1之間掃描。

1.6 菲律賓蛤仔提取純化物活性測(cè)定

1.6.1 細(xì)胞培養(yǎng)

取購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物細(xì)胞所細(xì)胞庫(kù)的DU-145細(xì)胞株，由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存，用10%小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基于溫度為37℃，CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.6.2 測(cè)定細(xì)胞增殖抑制率

檢測(cè)用MTT法。菲律賓蛤仔糖蛋白溶液的配制濃度分別為5、10、15、20、25、30 mg/mL。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成懸液，接種于96培養(yǎng)孔板中，每孔為200 μL，培養(yǎng)于CO2濃度為5%、培養(yǎng)箱溫度為37℃，貼壁4 h，之后分別加入不同濃度的菲律賓蛤仔糖蛋白溶液，每種濃度建3個(gè)平行孔，同時(shí)設(shè)對(duì)照組進(jìn)行對(duì)照，在5%的CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育48 h，然后加MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再吸去MTT，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上490 nm測(cè)吸光度，計(jì)算IR（細(xì)胞增殖抑制指數(shù)），計(jì)算公式見下：

IR=[(對(duì)照組A值-藥物組A值)/對(duì)照組A值]×100%

1.7 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)組測(cè)定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，取平均值為其結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 分離純化

經(jīng)水提醇沉后共得到6.5 g糖蛋白粗品。取4.3 g離子交換后得到1、2和3共3個(gè)峰，分別經(jīng)紫外和苯酚-硫酸法檢測(cè)，其中，峰2的蛋白峰和糖峰重合較好，且該峰峰值最高（圖1），為 0.1 mol/L NaCl溶液的洗脫組分，收集該峰，經(jīng)Sephadex G-25凝膠除鹽，冷凍干燥后得到1.96 g白色粉末狀易吸潮物質(zhì)，得率為0.98%。

圖1 糖蛋白DEAE-SepharoseFF洗脫圖譜Fig.1 Elution peak of DEAE-sepharoseFF

2.2 SDS-PAGE 電泳數(shù)據(jù)結(jié)果

峰2組分經(jīng)SDS-PAGE電泳，Bradford染色顯示為單一條帶，如圖2。

圖2 糖蛋白電泳圖Fig.2 SDS-PAGE of glycoprotein

2.3 理化性質(zhì)

經(jīng)檢測(cè)，圖1中峰2組分的糖含量為53.13%，蛋白含量為38.64%，易溶于水；紫外全波長(zhǎng)掃描顯示，峰2組分在268 nm處有特征吸收，如圖3；紅外光譜掃描結(jié)果表明，在3 290.10 cm-1處，有羥基伸縮振動(dòng)峰，2 940.04 cm-1處，是 CH伸縮振動(dòng)峰，這2個(gè)峰是糖類化合物典型的特征吸收峰；1 629.07 cm-1附近有強(qiáng)吸收,示有酰胺鍵的C=O鍵伸縮振動(dòng)及N-H鍵的變角振動(dòng)，是蛋白典型吸收峰；1 419.54 cm-1是COO-的吸收峰；1 000～1 200 cm-1是C-O-C和C-O-H伸縮振動(dòng)。在840 cm-1附近無吸收峰，在880 cm-1有吸收峰，說明多糖部分可能以β-糖苷鍵連接[10-11]。光譜掃描結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)所提取的峰2組分是糖和蛋白的復(fù)合物。

圖3 糖蛋白全波長(zhǎng)紫外掃描圖Fig.3 Ultraviolet spectra of glycoprotein

2.4 菲律賓蛤仔糖蛋白對(duì)DU-145細(xì)胞增殖的作用

不同濃度的菲律賓蛤仔糖蛋白作用于DU-145細(xì)胞48 h后，癌細(xì)胞出現(xiàn)明顯的增殖抑制現(xiàn)象，而且隨著濃度的增加抑制率逐漸增大，半數(shù)抑制濃度約為15.56 mg/mL，當(dāng)濃度為30 mg/mL時(shí)，抑制率達(dá)到72.49%，見表1。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中的提取物峰2組分在陰離子交換層析圖譜中顯示糖峰和蛋白峰完全重合，經(jīng)Bradford染色電泳圖中顯示為單一條帶，紅外光圖譜顯示其具有糖和蛋白的特征吸收峰，因此判斷該提取物可能為純度較高的單一糖蛋白。該糖蛋白體外對(duì)DU-145細(xì)胞具有顯著的增殖抑制活性，當(dāng)濃度為15～25 mg/mL時(shí)，對(duì)癌細(xì)胞的增殖抑制作用明顯增強(qiáng)，之后趨于平緩，因此判斷糖蛋白對(duì)DU-145細(xì)胞的最適作用濃度約為25 mg/mL。由于糖蛋白的結(jié)構(gòu)和活性功能比單純的糖類和蛋白質(zhì)類復(fù)雜，因此對(duì)于本實(shí)驗(yàn)中所提取的糖蛋白的分子量和一級(jí)結(jié)構(gòu)還有待于進(jìn)一步研究。此外，為了全面評(píng)價(jià)抗前腺癌活性，還應(yīng)測(cè)定其對(duì)前列腺癌細(xì)胞其它瘤譜的抑制作用，并且進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和活性作用機(jī)理研究對(duì)于將其開發(fā)成藥品或保健品也是必不可少的環(huán)節(jié)。

表1 糖蛋白對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖抑制率Tab.1 Inhibit rate of glycoprotein from peak1 on Prostate cancer cell

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