• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    TSHR和 RASSF1A基因甲基化與乳頭狀甲狀腺癌的相關(guān)性△

    2011-07-07 01:37:54南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院內(nèi)分泌科廣州510282
    陜西醫(yī)學(xué)雜志 2011年11期
    關(guān)鍵詞:癌基因甲基化甲狀腺癌

    南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院內(nèi)分泌科 (廣州 510282)

    戴亞麗 蔡德鴻* 陳 宏 張 振 張 樺 李 靜

    腫瘤的發(fā)生與原癌基因激活和抑癌基因失活,并最終引起基因表達(dá)異常有關(guān)?;虮磉_(dá)異??赡芡ㄟ^基因機(jī)制(Genetic mechanism)和表基因機(jī)制(Epigenetic mechanism)[1]來完成。 DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾,對(duì)維持染色體的結(jié)構(gòu)、X染色體的失活、基因印記和腫瘤的發(fā)生發(fā)展都起重要的作用,主要發(fā)生在啟動(dòng)子區(qū) CpG位點(diǎn)[2]。正常組織的腫瘤抑癌基因不發(fā)生甲基化,當(dāng)腫瘤抑癌基因發(fā)生甲基化后,就不能正常轉(zhuǎn)錄、翻譯合成抑癌蛋白及發(fā)揮抑癌作用,細(xì)胞就有可能發(fā)生單克隆增生形成腫瘤。

    乳頭狀甲狀腺癌(Papillary thyroid carcinoma,PTC)是甲狀腺最常見的惡性腫瘤,目前國外有研究報(bào)道甲狀腺癌的發(fā)生也與抑癌基因啟動(dòng)子甲基化的發(fā)生密切相關(guān)[3],本研究選擇了兩種抑癌基因:促甲狀腺激素受體(Thyroid stimulating hormone receptor,T SHR)和 RASSF1A基因,采用甲基化特異性 PCR(Methylation-specific PCR,M SP)法 ,對(duì) PTC及對(duì)照組織進(jìn)行研究,來探討 PTC的發(fā)生機(jī)制。

    對(duì)象和方法

    1 研究對(duì)象 研究組為我院甲乳外科 2007~2009年收治的 50例 PTC患者(PTC組),男 15例,女35例,平均年齡 (40± 12)歲;對(duì)照組為我院甲乳外科同期收治的 32例良性甲狀腺腫瘤患者,其中結(jié)節(jié)性甲狀腺腫 20例,甲狀腺腺瘤 12例;男 9例,女 23例,平均年齡(37±12)歲。兩組均為新鮮手術(shù)標(biāo)本,經(jīng)病理檢查確診,標(biāo)本切除后迅速轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。

    2 方 法

    2.1 組織 DNA的提取:使用 QIAamp DNA Mini Kits 51304基因組提取試劑盒(美國 Qiagen公司)按說明書提取基因組 DNA,紫外分光光度儀檢測(cè)其含量和純度。

    2.2 DNA甲基化修飾:使用 Cp GenomeTMDNA Modification Kit S7820(CHEMICON公司 )試劑盒對(duì)提取的 DNA進(jìn)行亞硫酸氫鈉處理和純化。

    2.3 甲基化特異性 PCR(MSP)擴(kuò)增:兩種抑癌基因的甲基化引物與非甲基化引物序列參照文獻(xiàn)[4,5],見表 1,由上海生工公司合成。 PCR反應(yīng)體系 25 μ l,上下游引物各 1 μ l(10pmol/μ l),甲基化修飾后的 DNA 2 μ l,所 用 試 劑 盒 為 2× PCR master mix K0171(Fermentas公司)。 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

    兩種抑癌基因 PCR(甲基化與非甲基化)擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性 5min,95℃變性 30s,65℃(TSHR基因)/60℃(RASSF1A基因 )退火 30s,72℃延伸 30s,循環(huán) 30個(gè)周期,最后 72℃延伸 5min。

    2.4 抑癌基因克隆及測(cè)序:每個(gè)抑癌基因各隨機(jī)選取 2例 PTC及 2例對(duì)照組織(均包含甲基化標(biāo)本及未甲基化標(biāo)本各 1例),首先進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,克隆后再測(cè)序。

    2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,以Pearsoni2檢驗(yàn)分析兩個(gè)抑癌基因 PTC組與對(duì)照組間甲基化差別;PTC組 TSHR與 RASSF1A基因甲基化的相關(guān)性用 Spearman相關(guān)分析;以 Pearsoni2檢驗(yàn)分析 PTC組兩個(gè)抑癌基因啟動(dòng)子甲基化和主要的臨床病理參數(shù)的關(guān)系,P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

    表1 PCR所用引物序列及片段大小

    結(jié) 果

    1 兩種抑癌基因啟動(dòng)子甲基化分析:PTC患者中,發(fā)現(xiàn) 34/50例(68.0%)TSHR基因、30/50例(60.0%)RASSF1A基因啟動(dòng)子發(fā)生了甲基化;對(duì)照組患者中,7/32例(21.9%)TSHR基因、10/32例(31.3%)RASSF1A基因啟動(dòng)子發(fā)生甲基化;PTC組 TSHR基因和 RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化率均顯著高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖 1,2)。

    圖1 TSHR基因啟動(dòng)子 M SP電泳圖(Marker:100bp DN A標(biāo)記物,K、L:PTC組,Y、W:對(duì)照組,U:非甲基化條帶,M:甲基化條帶)

    圖2 RASSF1A基因啟動(dòng)子 M SP電泳圖(Marker:100 bp DN A標(biāo)記物,K、L、M、N、O、Q:乳頭狀甲狀腺癌,上排 U、Y、Z:對(duì)照組織標(biāo)本,下排 U:非甲基化條帶,M:甲基化條帶)

    圖3 測(cè)序圖(TSHR基因啟動(dòng)子甲基化者 CpG島中的 C仍為 C,未甲基化者 C均轉(zhuǎn)變?yōu)?T)

    2 測(cè)序結(jié)果:兩個(gè)基因啟動(dòng)子發(fā)生了甲基化的,其所有 CpG位點(diǎn)堿基均發(fā)生了改變,即甲基化引物擴(kuò)增產(chǎn)物中的 CpG位點(diǎn)的 C仍然保持 C,而非甲基化引物擴(kuò)增產(chǎn)物中的 CpG位點(diǎn)中的 C轉(zhuǎn)變?yōu)?T(圖 3,4)。

    3 PTC組 TSHR和 RASSF1A基因甲基化間的關(guān)系:PTC組織中 TSHR和 RASSF1A基因啟動(dòng)子均甲基化的為 26/50;TSHR甲基化而 RASSF1A基因未甲基化的為 8/50;TSHR未甲基化而 RASSF1A基因甲基化的為 4/50;TSHR和 RASSF1A基因啟動(dòng)子均未甲基化的為 12/50。計(jì)算 r=0.490(P=0.000),提示 PTC組 TSHR和 RASSF1A兩個(gè)抑癌基因甲基化之間存在顯著相關(guān)性。

    4 兩個(gè)抑癌基因甲基化與患者臨床病理資料之間的關(guān)系:結(jié)合患者的臨床病理資料,TSHR和RASSF1A基因甲基化與患者的年齡、性別、臨床分期均未見相關(guān)性;TSHR基因與患者是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),RASSF1A基因與患者是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān) ,見表 2。

    圖4 測(cè)序圖(RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化者 CpG島中的 C仍為 C,未甲基化者 C均轉(zhuǎn)變?yōu)?T)

    表2 兩個(gè)抑癌基因啟動(dòng)子甲基化和主要臨床病理參數(shù)的關(guān)系

    討 論

    表基因機(jī)制主要指 DNA 5’CpG島胞嘧啶甲基化改變[1],引起基因表達(dá)異常。腫瘤中 DNA甲基化異常表現(xiàn)為基因中散在的 CpG位點(diǎn)甲基化普遍下降和區(qū)域性 CpG島高甲基化并存及細(xì)胞總的甲基化能力升高。目前人們已在多種腫瘤(乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、腎癌、鼻咽癌等)的發(fā)生中證實(shí)抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[6],有關(guān)甲狀腺腫瘤與抑癌基因甲基化的關(guān)系,國外也有相關(guān)報(bào)道。

    Jason等[5]對(duì) 32例 PTC患者和 27例對(duì)照組采用MSP方法進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn) T SHR在癌組織的甲基化率為 34%,在對(duì)照組中為 7%,兩者存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,并且在甲狀腺癌組發(fā)現(xiàn)了 TSHR甲基化的腫瘤復(fù)發(fā)率高,未發(fā)生甲基化的腫瘤復(fù)發(fā)率低,他們認(rèn)為抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化是甲狀腺癌的一個(gè)惡性標(biāo)記。Schagdarsurengin等[7]采用 MSP法 ,對(duì) 13例 PTC,10例濾泡型甲狀腺癌,9例未分化甲狀腺癌,6例髓樣甲狀腺癌,12例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫及 10例濾泡型腺瘤進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn) PTC患者 TSHR啟動(dòng)子甲基化率為58%,未分化甲狀腺癌為 86%,而在對(duì)照組達(dá)到 80%,T SHR啟動(dòng)子甲基化率僅在未分化癌中較其他甲狀腺癌高。唐建東[8]等用 M SP法在 PTC組織中發(fā)現(xiàn)RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化的發(fā)生率為 55.9%(19/34),癌旁組織中甲基化的發(fā)生率為 23.5%(8/34),認(rèn)為甲基化可能與 PTC發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

    我們使用 MSP法,檢測(cè)了 50例 PTC和 32例對(duì)照 TSHR和 RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化情況,發(fā)現(xiàn)了兩種抑癌基因啟動(dòng)子的甲基化頻率在 PTC中明顯高于對(duì)照組(P<0.05);測(cè)序結(jié)果證實(shí)了兩個(gè)基因啟動(dòng)子 CpG島的所有 CpG位點(diǎn)均發(fā)生了甲基化。有研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)抑癌基因啟動(dòng)子甲基化在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有協(xié)同作用,多個(gè)抑癌基因甲基化對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響可能較單一基因甲基化更為重要[5]。我們進(jìn)一步對(duì)兩種抑癌基因甲基化之間相關(guān)性進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)T SHR和 RASSF1A之間存在關(guān)聯(lián)性,這可能是由于兩種抑癌基因的作用環(huán)節(jié)相同:TSHR基因和RASSF1A基因都主要作用于信號(hào)傳導(dǎo)[9]。 PTC組兩種抑癌基因啟動(dòng)子甲基化,均與腫瘤的臨床分期無關(guān),提示兩種抑癌基因啟動(dòng)子甲基化可能在甲狀腺腫瘤的早期階段既已發(fā)生;但 TSHR基因啟動(dòng)子甲基化率在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的 PTC高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例,提示該抑癌基因啟動(dòng)子甲基化在甲狀腺癌的惡性進(jìn)展中可能發(fā)揮一定作用。僅從我們的研究結(jié)果表明,在 PTC中兩種抑癌基因啟動(dòng)子的高甲基化可能抑制了抑癌基因的表達(dá),使得抑癌基因?qū)?PTC的抑制作用減少,從而促進(jìn)了 PTC的發(fā)生和發(fā)展,另 TSHR基因和RASSF1A基因在 PTC的發(fā)生中可能起到協(xié)同作用。因此,我們的研究提供了證據(jù):在 PTC中異常的抑癌基因啟動(dòng)子甲基化可能是抑癌基因沉寂的一個(gè)重要機(jī)制。

    總之,我們?cè)?PTC的研究顯示了 TSHR和RASSF1A兩種基因異常的甲基化在 PTC中是一種較普遍的現(xiàn)象,可能是基因沉寂的一個(gè)潛在分子通路,與 PTC的發(fā)生、發(fā)展有一定聯(lián)系。雖然 DNA甲基化是一個(gè)復(fù)雜的過程,許多細(xì)節(jié)尚未明了,但隨著對(duì)這一領(lǐng)域研究的深入以及對(duì)于腫瘤發(fā)生機(jī)制的逐漸明釋,我們相信它對(duì)于腫瘤早期預(yù)測(cè)與干預(yù)以及預(yù)后評(píng)估等將會(huì)有重要作用。

    [1]Byun DS,Lee M G,Chae KS,et al.Frequent epigenetic inactivation of RASSF1A by aberrant promoter hypermethylation in human gastric adenocarcinoma[J].Cancer Res,2001,61(19):7034-7038.

    [2]Partha M,Rakesh S.DNA methylation and cancer[J].J Clin Oncol,2004,22(15):4632-4642.

    [3]Xing M,Usadel H,Cohen Y,et al.Methylation of the thyroid-stimulating hormone receptorgene in epithelial thyroid tumors-a marker of malignancy and a cause of gene silencing[J].Cancer Res,2003,63(5):2316-2321.

    [4]Jason A,Chun-Yang Fan,ChunlaiZou,etal.Methylation status of genes in papillary thyroid carcinoma[J].Arch Otolaryngol Head Neck Surg,2007,133(10):1006-1011.

    [5]Schagdarsuregin U,Gimm O,Cuong Hoang-Vu C,et al. Frequent epigenetic silencing ofthe CpG island promoter of RASSF1A in thyroid carcinoma[J].Cancer Res,2002,62(12):3698-3701.

    [6]劉桂芝,吳逸明,楊繼要,等.非小細(xì)胞肺癌組織中RASSF1A和 P16基因啟動(dòng)子甲基化研究 [J].陜西醫(yī)學(xué)雜志,2007,5(36):515-520.

    [7]Schagdarsurengin U,Gimm O,Dralle H,et al.CpG island methylation of tumor-related promoters occurs preferentially in undifferentiated carcinoma[J].Thyroid,2006,16(7):633-642.

    [8]唐建東,歐陽軍,栗夏蓮,等.甲狀腺乳頭狀癌組織中RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化與臨床病理學(xué)的關(guān)系 [J].天津醫(yī)藥,2007,35(12):887-889.

    [9]Tommasi S,Dammann R,Jim SG,et al.RASSF3 and NORE1: identification and cloing of two human homologuesoftheputativetumorsuppressorgene RASSF1[J].Oncogene,2002,21(17):2713-2720.

    猜你喜歡
    癌基因甲基化甲狀腺癌
    分化型甲狀腺癌切除術(shù)后多發(fā)骨轉(zhuǎn)移一例
    分化型甲狀腺癌肺轉(zhuǎn)移的研究進(jìn)展
    抑癌基因P53新解讀:可保護(hù)端粒
    健康管理(2016年2期)2016-05-30 21:36:03
    全甲狀腺切除術(shù)治療甲狀腺癌適應(yīng)證選擇及并發(fā)癥防治
    探討抑癌基因FHIT在皮膚血管瘤中的表達(dá)意義
    抑癌基因WWOX在口腔腫瘤的研究進(jìn)展
    鼻咽癌組織中SYK基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化分析
    胃癌DNA甲基化研究進(jìn)展
    基因組DNA甲基化及組蛋白甲基化
    遺傳(2014年3期)2014-02-28 20:58:49
    抑癌基因p53在裸鼴鼠不同組織中表達(dá)水平的差異
    国产中年淑女户外野战色| 精品久久久噜噜| 亚洲四区av| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 精品国产三级普通话版| 午夜福利高清视频| 全区人妻精品视频| 中国美白少妇内射xxxbb| 欧美另类亚洲清纯唯美| 久久精品夜色国产| 99九九线精品视频在线观看视频| 亚洲美女视频黄频| 亚洲av中文av极速乱| 12—13女人毛片做爰片一| 黄色配什么色好看| 91精品一卡2卡3卡4卡| 丝袜喷水一区| 婷婷色av中文字幕| 一级毛片我不卡| 乱人视频在线观看| 深夜精品福利| 亚洲欧美日韩无卡精品| 在线观看免费视频日本深夜| 精品久久久噜噜| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产美女午夜福利| 听说在线观看完整版免费高清| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 老司机福利观看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 午夜亚洲福利在线播放| 黑人高潮一二区| 亚洲自拍偷在线| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲成人av在线免费| 波多野结衣巨乳人妻| 久久精品国产亚洲av天美| 成年免费大片在线观看| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 日本欧美国产在线视频| 亚洲精品久久国产高清桃花| 69人妻影院| 日韩成人av中文字幕在线观看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| av在线天堂中文字幕| 国产高清有码在线观看视频| 欧美激情在线99| 观看美女的网站| av在线天堂中文字幕| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产精品精品国产色婷婷| 亚洲18禁久久av| 久久久成人免费电影| 免费av毛片视频| 国产一区二区在线观看日韩| www日本黄色视频网| 日韩中字成人| 看非洲黑人一级黄片| 精华霜和精华液先用哪个| 最好的美女福利视频网| 国产精品无大码| 欧美bdsm另类| 国产 一区精品| 亚洲成人精品中文字幕电影| 2021天堂中文幕一二区在线观| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产亚洲5aaaaa淫片| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 草草在线视频免费看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 日韩欧美在线乱码| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 亚洲精品色激情综合| 99热网站在线观看| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲欧美精品专区久久| 中文欧美无线码| 热99在线观看视频| av天堂在线播放| 波多野结衣高清无吗| 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 欧美日本视频| 欧美+日韩+精品| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产高清三级在线| 精品久久久噜噜| 国产精品野战在线观看| 欧美潮喷喷水| 欧美潮喷喷水| 成人午夜精彩视频在线观看| 啦啦啦韩国在线观看视频| av在线老鸭窝| 精品久久久久久久久久免费视频| 麻豆一二三区av精品| 中文资源天堂在线| 在线播放无遮挡| 国产精品人妻久久久久久| 国产亚洲精品av在线| 欧美日韩国产亚洲二区| 久久久欧美国产精品| 内射极品少妇av片p| 亚洲无线观看免费| 黄色配什么色好看| .国产精品久久| 美女脱内裤让男人舔精品视频 | 免费观看a级毛片全部| 少妇人妻一区二区三区视频| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 精品人妻视频免费看| 精品人妻偷拍中文字幕| 精品久久久久久久久久免费视频| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产精华一区二区三区| 国产69精品久久久久777片| 国产真实伦视频高清在线观看| 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲中文字幕日韩| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲国产高清在线一区二区三| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 亚洲在线观看片| 国产 一区 欧美 日韩| 日韩大尺度精品在线看网址| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 中国美白少妇内射xxxbb| 精品久久久噜噜| 成人综合一区亚洲| 尾随美女入室| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 男女那种视频在线观看| 观看免费一级毛片| 麻豆一二三区av精品| 伊人久久精品亚洲午夜| 少妇熟女aⅴ在线视频| 欧美+日韩+精品| 日韩欧美在线乱码| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 国产在线男女| 日韩国内少妇激情av| 久久久久久久久久久免费av| 成人特级黄色片久久久久久久| 久久热精品热| 最好的美女福利视频网| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产精品一及| 长腿黑丝高跟| av在线天堂中文字幕| 亚洲国产精品成人综合色| 日韩高清综合在线| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲久久久久久中文字幕| 精品国内亚洲2022精品成人| 久久久久免费精品人妻一区二区| 我要看日韩黄色一级片| 91久久精品国产一区二区成人| 久久久久九九精品影院| 亚洲国产色片| 久久精品夜色国产| 国产精品蜜桃在线观看 | 看免费成人av毛片| 女同久久另类99精品国产91| 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产爱豆传媒在线观看| 蜜臀久久99精品久久宅男| av国产免费在线观看| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 在线观看一区二区三区| 深夜精品福利| 日韩强制内射视频| 亚洲va在线va天堂va国产| 99热6这里只有精品| 国产v大片淫在线免费观看| 午夜久久久久精精品| 联通29元200g的流量卡| 欧美最新免费一区二区三区| 在线观看免费视频日本深夜| 天堂中文最新版在线下载 | 亚洲欧美成人精品一区二区| 黄色一级大片看看| 国产精品1区2区在线观看.| 一区二区三区高清视频在线| 国产真实伦视频高清在线观看| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 亚洲无线在线观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产真实乱freesex| 国产精品蜜桃在线观看 | 看十八女毛片水多多多| 亚洲av中文av极速乱| 国产精品av视频在线免费观看| 一级毛片电影观看 | 村上凉子中文字幕在线| 五月伊人婷婷丁香| 高清日韩中文字幕在线| 国产精品三级大全| 毛片一级片免费看久久久久| 成人av在线播放网站| 色尼玛亚洲综合影院| 午夜免费男女啪啪视频观看| 日本成人三级电影网站| 久久精品人妻少妇| 免费av毛片视频| 日韩强制内射视频| 插阴视频在线观看视频| 99热全是精品| 又爽又黄a免费视频| 人人妻人人看人人澡| 国产黄片美女视频| 精品一区二区免费观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 亚洲av免费在线观看| 日韩欧美三级三区| 亚洲第一电影网av| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲无线观看免费| 国产成人精品久久久久久| 久久国产乱子免费精品| 国产成年人精品一区二区| 校园人妻丝袜中文字幕| 成人av在线播放网站| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 看黄色毛片网站| 亚洲av二区三区四区| 色哟哟哟哟哟哟| 热99在线观看视频| 18禁在线播放成人免费| a级毛片a级免费在线| 一夜夜www| av女优亚洲男人天堂| 免费看av在线观看网站| 18+在线观看网站| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 国产精品乱码一区二三区的特点| 久久久久久九九精品二区国产| www日本黄色视频网| 精品午夜福利在线看| 欧美性感艳星| 99热全是精品| 黄色欧美视频在线观看| 看十八女毛片水多多多| 国产三级中文精品| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 欧美激情在线99| 麻豆乱淫一区二区| 美女被艹到高潮喷水动态| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产人妻一区二区三区在| 99热这里只有精品一区| 亚洲人成网站在线观看播放| 久久久久久久久久成人| 欧美精品一区二区大全| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 18禁在线播放成人免费| 三级毛片av免费| 成人美女网站在线观看视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 天堂中文最新版在线下载 | 99久久久亚洲精品蜜臀av| 久久久久久久久久黄片| 精品久久久久久久末码| 校园春色视频在线观看| 搞女人的毛片| 久久久午夜欧美精品| 哪里可以看免费的av片| 国产精华一区二区三区| 亚洲国产精品久久男人天堂| 久久久久久久久久成人| 2022亚洲国产成人精品| 国产av不卡久久| 性插视频无遮挡在线免费观看| 欧美丝袜亚洲另类| 国产av麻豆久久久久久久| 亚洲电影在线观看av| 国产一区二区在线观看日韩| 一级毛片久久久久久久久女| 最近2019中文字幕mv第一页| 丝袜喷水一区| 看免费成人av毛片| 黄片无遮挡物在线观看| 激情 狠狠 欧美| 最近的中文字幕免费完整| 美女被艹到高潮喷水动态| 麻豆久久精品国产亚洲av| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 亚洲av熟女| 成年免费大片在线观看| 赤兔流量卡办理| ponron亚洲| 亚洲18禁久久av| 一本久久中文字幕| 级片在线观看| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产精品免费一区二区三区在线| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产久久久一区二区三区| 91精品一卡2卡3卡4卡| 国产三级中文精品| 日韩强制内射视频| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲欧美日韩东京热| 中文欧美无线码| 中文字幕熟女人妻在线| 韩国av在线不卡| 中国美白少妇内射xxxbb| 少妇被粗大猛烈的视频| 嫩草影院精品99| 国产麻豆成人av免费视频| av专区在线播放| 人妻夜夜爽99麻豆av| 91麻豆精品激情在线观看国产| 久久九九热精品免费| 中文字幕久久专区| 亚洲精品亚洲一区二区| 高清日韩中文字幕在线| 在线观看午夜福利视频| 十八禁国产超污无遮挡网站| 三级国产精品欧美在线观看| 国产精品三级大全| 日本黄色片子视频| 国产免费男女视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产高清有码在线观看视频| 午夜精品国产一区二区电影 | 免费看日本二区| 国产伦理片在线播放av一区 | 免费观看人在逋| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 精品久久国产蜜桃| 在线免费观看不下载黄p国产| 日韩在线高清观看一区二区三区| 免费看a级黄色片| 91在线精品国自产拍蜜月| 一级av片app| 日韩av在线大香蕉| 国产视频内射| 国产探花极品一区二区| av免费观看日本| 欧美激情在线99| 又爽又黄a免费视频| 两个人的视频大全免费| 国产一区二区激情短视频| 乱系列少妇在线播放| 欧美变态另类bdsm刘玥| 久久欧美精品欧美久久欧美| 18禁在线播放成人免费| 国产精品蜜桃在线观看 | 亚洲av中文av极速乱| 激情 狠狠 欧美| 极品教师在线视频| 国产毛片a区久久久久| 日韩精品有码人妻一区| 国产精华一区二区三区| 久久这里有精品视频免费| 国产爱豆传媒在线观看| 久久久久久久午夜电影| 日本黄色片子视频| 网址你懂的国产日韩在线| 深夜精品福利| 欧美xxxx性猛交bbbb| 麻豆成人av视频| eeuss影院久久| 中国美女看黄片| 99精品在免费线老司机午夜| 日本免费一区二区三区高清不卡| 日韩成人av中文字幕在线观看| 成年av动漫网址| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲自偷自拍三级| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 2021天堂中文幕一二区在线观| 日本爱情动作片www.在线观看| 欧美高清性xxxxhd video| 在线观看66精品国产| 国产亚洲91精品色在线| 干丝袜人妻中文字幕| 国产精品.久久久| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 好男人在线观看高清免费视频| 久久久精品大字幕| 村上凉子中文字幕在线| 一区二区三区免费毛片| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| av在线老鸭窝| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 男女视频在线观看网站免费| 青春草视频在线免费观看| 人人妻人人澡欧美一区二区| 欧美激情在线99| 免费观看精品视频网站| 少妇人妻一区二区三区视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 赤兔流量卡办理| 男人舔女人下体高潮全视频| 禁无遮挡网站| 色5月婷婷丁香| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产麻豆成人av免费视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 男人舔女人下体高潮全视频| 色吧在线观看| 天堂影院成人在线观看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 一区二区三区免费毛片| 一区二区三区四区激情视频 | 一级黄片播放器| 干丝袜人妻中文字幕| 久久久久久久亚洲中文字幕| 精品一区二区三区人妻视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲不卡免费看| 欧美精品一区二区大全| 欧美zozozo另类| 精品国内亚洲2022精品成人| 美女大奶头视频| 国产真实乱freesex| 少妇高潮的动态图| 舔av片在线| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲第一电影网av| 最好的美女福利视频网| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 91精品一卡2卡3卡4卡| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 成年免费大片在线观看| 国产午夜福利久久久久久| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产在线男女| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 夜夜夜夜夜久久久久| 久久精品91蜜桃| 岛国在线免费视频观看| 美女被艹到高潮喷水动态| 日韩制服骚丝袜av| 欧美丝袜亚洲另类| 久久精品91蜜桃| av视频在线观看入口| 看黄色毛片网站| 丰满的人妻完整版| 久久久久性生活片| 寂寞人妻少妇视频99o| 两个人视频免费观看高清| 啦啦啦韩国在线观看视频| 一区福利在线观看| 国产麻豆成人av免费视频| 在线观看66精品国产| 乱人视频在线观看| 国产高清三级在线| 国产不卡一卡二| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 大香蕉久久网| 有码 亚洲区| 级片在线观看| 亚洲精品日韩av片在线观看| 老司机影院成人| 黄色日韩在线| 中文字幕熟女人妻在线| 精品久久久噜噜| 热99在线观看视频| 成人二区视频| ponron亚洲| 国模一区二区三区四区视频| 久久精品国产清高在天天线| 亚洲av免费在线观看| 久久久国产成人精品二区| 成人毛片a级毛片在线播放| 美女内射精品一级片tv| 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲国产欧美在线一区| 日本在线视频免费播放| 国产真实伦视频高清在线观看| 好男人在线观看高清免费视频| 小说图片视频综合网站| 欧美成人a在线观看| 中文资源天堂在线| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 九九爱精品视频在线观看| 午夜福利在线在线| 麻豆成人午夜福利视频| 小说图片视频综合网站| 欧美zozozo另类| 在线播放无遮挡| 成年女人永久免费观看视频| 一本精品99久久精品77| 精品人妻视频免费看| 亚洲国产色片| 在线观看免费视频日本深夜| 日日干狠狠操夜夜爽| 在线播放无遮挡| 国产黄a三级三级三级人| 日本一本二区三区精品| 久久精品国产自在天天线| 日本黄色片子视频| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲国产精品成人久久小说 | av在线播放精品| 欧美+日韩+精品| 嫩草影院精品99| 免费一级毛片在线播放高清视频| 97超视频在线观看视频| 在线播放国产精品三级| 深夜a级毛片| 久久精品夜色国产| 两个人的视频大全免费| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产成人一区二区在线| 哪里可以看免费的av片| 国产精品久久久久久久久免| 国产熟女欧美一区二区| 免费人成视频x8x8入口观看| 免费看光身美女| 日本免费a在线| 国产亚洲精品av在线| 国产精品三级大全| 中文字幕久久专区| 国产高清视频在线观看网站| 国产 一区 欧美 日韩| 婷婷六月久久综合丁香| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产亚洲5aaaaa淫片| 久99久视频精品免费| 悠悠久久av| 亚洲最大成人手机在线| 精品熟女少妇av免费看| 国产精品久久久久久av不卡| 欧美人与善性xxx| 舔av片在线| 中文资源天堂在线| 日韩强制内射视频| 久久久欧美国产精品| 变态另类丝袜制服| 国内精品久久久久精免费| 国产成人精品婷婷| av在线老鸭窝| 高清日韩中文字幕在线| 级片在线观看| 亚洲av.av天堂| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 丰满的人妻完整版| 午夜久久久久精精品| 91麻豆精品激情在线观看国产| 又爽又黄a免费视频| 美女国产视频在线观看| 高清毛片免费看| 少妇丰满av| 国产91av在线免费观看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 亚洲精品456在线播放app| 深夜a级毛片| 国产v大片淫在线免费观看| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 久久久久性生活片| 最好的美女福利视频网| 老司机影院成人| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲高清免费不卡视频| 一个人看的www免费观看视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 少妇熟女aⅴ在线视频| а√天堂www在线а√下载| 亚洲最大成人中文| 欧美zozozo另类| 亚洲av二区三区四区| 国产精品久久久久久av不卡| 久久久久久久久久久免费av| av卡一久久| 搞女人的毛片| 激情 狠狠 欧美| 亚洲无线观看免费| av在线天堂中文字幕| 亚洲无线观看免费| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产精品不卡视频一区二区| 免费大片18禁| 亚洲,欧美,日韩| 日本免费a在线| 一个人看视频在线观看www免费| 一区二区三区四区激情视频 | 久久久久久国产a免费观看| 在线播放国产精品三级| 国产精品一及| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲内射少妇av| 91精品一卡2卡3卡4卡| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 中文资源天堂在线| 免费观看人在逋| 国产毛片a区久久久久| 一区二区三区四区激情视频 | 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| www.av在线官网国产| 日本爱情动作片www.在线观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 国产黄片视频在线免费观看| 国产毛片a区久久久久| 午夜老司机福利剧场| 女同久久另类99精品国产91| 久久久色成人| 欧美又色又爽又黄视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲图色成人|