海藻酸鈉包埋脫氮菌株工藝研究

酒衛(wèi)敬, 汪 蘋, 李?yuàn)W搏, 李金穗, 其其格

細(xì)胞固定化技術(shù),是利用物理或化學(xué)手段將游離的微生物(細(xì)胞)或酶,定位于限定的空間區(qū)域,并使其保持活性且能反復(fù)利用的一項(xiàng)技術(shù)[1].固定化技術(shù)起初用于滴濾反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)生產(chǎn)醋酸[2],后來(lái),應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、發(fā)酵工業(yè)中,近30年開始應(yīng)用于廢水處理領(lǐng)域[3].日本、荷蘭在硝化細(xì)菌固定化技術(shù)方面作了一些研究[4-5],國(guó)內(nèi)也有些學(xué)者致力于這方面的研究[6-8].采用固定化技術(shù)能高效率地將微生物或酶限制在特定的材料區(qū)域內(nèi)部,達(dá)到提高微生物或酶的濃度、減少微生物流失、容易固液分離的目的.用固定化微生物技術(shù)處理廢水,具備承受有毒物質(zhì)沖擊能力并能降解難生化有機(jī)物,成為最近幾十年廢水生物處理中的研究熱點(diǎn).

本實(shí)驗(yàn)用海藻酸鈉包埋脫氮菌株,并對(duì)包埋工藝及脫氮性能進(jìn)行了研究,為其在工業(yè)方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ).包埋菌株可用于氨基酸廢水、發(fā)酵廢水、制藥廢水等多種含氮廢水的有效脫氮.

根據(jù)微生物細(xì)胞與載體的作用力及作用形式、微生物細(xì)胞被固定的狀態(tài)以及載體的性質(zhì),將固定化細(xì)胞的制備方法分為以下三類:吸附法、包埋法和交聯(lián)法.其中,包埋法應(yīng)用較多,尤其以凝膠包埋法在工業(yè)中的應(yīng)用最為廣泛[9-10].

固定化載體通常分為有機(jī)載體和無(wú)機(jī)載體兩種,實(shí)際應(yīng)用的主要是有機(jī)載體,其中,目前應(yīng)用最多的是海藻酸鈉和聚乙烯醇.海藻酸鈉作為天然高分子多糖類,用于細(xì)胞固定化,盡管強(qiáng)度不高,但對(duì)微生物無(wú)毒害作用,固定方法簡(jiǎn)單,成本適中,是很好的包埋劑選擇.筆者選用海藻酸鈉作為包埋劑,用包埋法固定化脫氮菌株,可應(yīng)用于氨基酸廢水、發(fā)酵廢水、制藥廢水等多種含氮廢水的有效脫氮.

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

一株具有異養(yǎng)硝化好氧反硝化脫氮性能的戴爾福特菌(Delftia),編號(hào)為WXZ-2;海藻酸鈉,氯化鈣.

異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基:(NH4)2SO4為0.47 g/L,檸檬酸三鈉(C6H5Na3O7·2H2O)為5.1 g/L;碳源用量依據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)COD/N比調(diào)節(jié),KNO3為0.1 g/L,維氏鹽溶液為50 mL/L;用蒸餾水溶解,并同時(shí)調(diào)節(jié)初始pH值.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 固定化小球的制備過(guò)程

固定化水球的制備流程見圖1.

圖1 固定化小球的制備流程Fig.1 Process of forming immobilized beads

1.2.2 測(cè)定方法

ρ(NH+4-N)采用納氏試劑分光光度法測(cè)定;ρ(NO2-N)采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法測(cè)定;ρ(NO3-N)采用紫外分光光度法測(cè)定;pH值采用德國(guó)WTW便攜式測(cè)定儀測(cè)定.

2 結(jié)果與討論

2.1 海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍的選擇

小球的成球情況與海藻酸鈉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有很大關(guān)系,見表1.由表1可以看出,SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3% ～7%時(shí)可滴制出形狀較好的包埋小球.

表1 海藻酸鈉(SA)質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)成球狀況的影響Tab.1 Effects of different concentration of sodium alginateon shape of immobilized beads

2.2 優(yōu)化包埋條件

2.2.1 正交試驗(yàn)

在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)了四因素三水平正交試驗(yàn),各因素和各水平的選擇是參考有關(guān)研究[11-13]擬定的.試驗(yàn)因素有:加入包埋劑中的細(xì)菌量(簡(jiǎn)稱包菌量)、包埋劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)、交聯(lián)時(shí)間及小球直徑,以固定化菌株的脫氮性能(即:氨氮和總氮去除率)為指標(biāo).通過(guò)正交試驗(yàn),優(yōu)選包埋條件.各因素因子的水平取值見表2.

按1.1配制異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基,調(diào)節(jié)pH值至7.0,并分裝在250 mL的錐形瓶中,在121℃條件下高壓滅菌20 min,然后放到已滅菌的操作臺(tái)中冷卻至室溫.稱取濕重為10 g(相當(dāng)于干重約1 g)的小球,放至培養(yǎng)基中.然后放在恒溫振蕩搖床內(nèi)培養(yǎng).

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Tab.2 Orthogoal experiments design table

培養(yǎng)條件為:溫度為30℃,轉(zhuǎn)速為90 r/min(相當(dāng)于DO質(zhì)量濃度3.76～4.84 mg/L),COD/N為25,氮源為硝酸鉀和硫酸銨,初始NO3--N和NH4+-N質(zhì)量濃度分別約為10 mg/L和100 mg/L,碳源為檸檬酸三鈉.培養(yǎng)4天,每隔24 h取樣一次,取樣后先離心分離,然后取上清液對(duì) NH4+-N、NO3--N 和NO2--N質(zhì)量濃度進(jìn)行測(cè)定,TN質(zhì)量濃度為NH4+-N、NO3--N和NO2--N質(zhì)量濃度之和,計(jì)算NH4+-N和TN去除率,取其最大值.實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3.

表3中數(shù)據(jù)說(shuō)明:

1)氨氮去除率與總氮去除率最高組為同一組,即實(shí)驗(yàn)5,表觀優(yōu)選條件為A2B2C3D1.

2)表3中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示水平,j表示因素,如ⅡD表示小球直徑為3 mm的所有包埋條件,此條件在表中是試驗(yàn)2、試驗(yàn)6、試驗(yàn)7,ⅡD的值應(yīng)為3個(gè)對(duì)應(yīng)條件下的結(jié)果加權(quán)平均值.每個(gè)因素不同水平下的平均值相差最大的二個(gè)數(shù)的差值,即為極差Rj.極差的大小反映各因素對(duì)指標(biāo)影響的大小.即極差越大,因素對(duì)指標(biāo)影響越大.最優(yōu)水平的確定是根據(jù)Ⅰj、Ⅱj、Ⅲj的大小選定的,平均值越大表明該水平越有利于指標(biāo)結(jié)果,各最優(yōu)水平的綜合即為理論最優(yōu)條件.

1)數(shù)據(jù)計(jì)算:以因素B(SA濃度)為例,在因素B的1水平下有3組實(shí)驗(yàn),分別為1,4,7號(hào)實(shí)驗(yàn),歸為第一組.同樣,因素B的2水平下的2,5,8號(hào)實(shí)驗(yàn),歸為第二組.因素B的3水平下的3,6,9號(hào)實(shí)驗(yàn),歸為第三組.分別計(jì)算各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果加權(quán)平均值,填入表下部相應(yīng)列中的相應(yīng)位置上.如:

表3 WXZ-2號(hào)包埋小球的正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Orthogoal experimental results of beads immobilized with WXZ-2

三者中的最大值減去最小值即為極差,即:RB=ⅢB-ⅠB=75.6-68.5=7.1.由以上計(jì)算可知ⅠB＜ⅢB＜ⅡB,所以因素B的最佳水平應(yīng)取2水平,即SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%.其它同理.

2)因素影響分析:極差的大小反映各因素對(duì)指標(biāo)影響的大小.在實(shí)驗(yàn)的3個(gè)因素中,因素D的極差最大,為12.1,其次是C、B,A最小,從而可排出因素影響的順序?yàn)?D＞C＞B＞A,即小球直徑＞交聯(lián)時(shí)間＞SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞包菌量.

3)優(yōu)選方案的得出:由以上計(jì)算與分析可見各因素理論最佳水平為因素A取2水平,因素B取2水平,因素C取3水平,因素D取1水平.因此實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)方案為A2B2C3D1,即包菌量為4%,SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%,交聯(lián)時(shí)間為12 h,小球直徑為2 mm.

以TN去除率為指標(biāo)分析,分析方法同上,得出以下結(jié)論:

1)四因素三水平的理論最佳條件為:A2B2C3D1,即包菌量為4%、SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%、交聯(lián)時(shí)間為12 h,小球直徑為2 mm.與以NH+4-N去除率為指標(biāo)分析所得和表3中的表觀優(yōu)選條件均一致.

2)因素影響分析結(jié)果為:C＞B＞D＞A,即交聯(lián)時(shí)間＞SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞小球直徑＞包菌量.

無(wú)論以氨氮去除率為指標(biāo)還是以總氮去除率為指標(biāo),影響最小的因素都是因素A,即包菌量.

小球直徑是影響包埋菌株脫氮性能的一個(gè)重要因素.當(dāng)小球直徑減小,等重量小球的比表面積可能會(huì)增大,并有利于小球內(nèi)外物質(zhì)之間的交換,從而提高脫氮性能.但是包埋小球的直徑太小時(shí),滴制過(guò)程中易堵塞,會(huì)給制備過(guò)程帶來(lái)很多麻煩.因此,小球直徑2 mm為本實(shí)驗(yàn)的最小研究水平.SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)會(huì)影響固定化小球的機(jī)械強(qiáng)度、質(zhì)量傳遞等,進(jìn)而影響到微生物的活性.另外,濃度過(guò)高時(shí),包埋劑的粘性增加,給固定化操作帶來(lái)不便,2.1確定了本實(shí)驗(yàn)中海藻酸鈉濃度的研究范圍.海藻酸鈉在交聯(lián)劑中交聯(lián)的時(shí)間長(zhǎng)短會(huì)對(duì)固定化細(xì)胞的活性產(chǎn)生影響.由表3可以看出,隨著交聯(lián)時(shí)間的增長(zhǎng),包埋小球的脫氮性能增強(qiáng).因此,通過(guò)補(bǔ)充單因素實(shí)驗(yàn),研究交聯(lián)時(shí)間對(duì)包埋菌株脫氮性能的影響.

2.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

包菌量為4%,海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%,小球粒徑為2 mm條件下改變交聯(lián)時(shí)間進(jìn)行包埋實(shí)驗(yàn).本實(shí)驗(yàn)共選定4,8,12,16,20 h 5個(gè)水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn).實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2.

圖2 交聯(lián)時(shí)間對(duì)脫氮性能的影響Fig.2 Effects of crosslinking time on nitrogen removal

交聯(lián)時(shí)間越長(zhǎng),所得固定化凝膠小球的強(qiáng)度越高,但凝膠小球內(nèi)部的結(jié)構(gòu)更為緊密,不利于基質(zhì)的傳遞,從而使細(xì)胞失活率增大,因此,交聯(lián)時(shí)間不宜太長(zhǎng).由圖2可以看出,實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)最佳交聯(lián)時(shí)間為12 h,氨氮去除率為92.8%,總氮去除率為94.3%.

根據(jù)正交試驗(yàn)和單因素實(shí)驗(yàn),選定WXZ-2在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)的最佳包埋條件是包菌量為4%,海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%,交聯(lián)時(shí)間為12 h,小球粒徑為2 mm.包埋小球的最高氨氮去除率能達(dá)到92.8%,總氮去除率能達(dá)到94.3%.

3 結(jié) 論

1)通過(guò)正交試驗(yàn)和單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)選出海藻酸鈉包埋脫氮菌株WXZ-2在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)的最佳包埋條件:包菌量為4%,海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%,交聯(lián)時(shí)間為12 h,小球粒徑為2 mm.包埋小球的最高氨氮去除率能達(dá)到92.8%,總氮去除率能達(dá)到94.3%.

2)包埋后的菌株的脫氮性能與游離菌的脫氮性能(氨氮去除率94.9%,總氮去除率為95.3%[14])相當(dāng).

3)海藻酸鈉包埋法制備過(guò)程簡(jiǎn)單,適用于脫氮菌株WXZ-2的固定化.可以解決菌株的保存、運(yùn)輸問(wèn)題,為優(yōu)勢(shì)菌株廣泛應(yīng)用于實(shí)際工程奠定了基礎(chǔ).

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