Bcl-2 sh RN A慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定*

西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院 (西安 710004)饒國(guó)洲 李 昂 朱永進(jìn) 齊 紅 張引成

RNA干擾作用為實(shí)驗(yàn)研究提供了一種高效、快捷的抑制特異性基因表達(dá)的技術(shù)手段和工具,并有助于研究該基因在生物模型中的作用機(jī)制,以及腫瘤基因治療研究的新策略。bcl-2是較早發(fā)現(xiàn)的一種重要的調(diào)亡抑制基因,研究表明 bcl-2基因的高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[1],由于 bcl-2具有獨(dú)立耐藥基因與抗凋亡基因從而導(dǎo)致對(duì)放、化療的不敏感性[2],使得臨床對(duì)腫瘤治療效果不盡理想的原因之一。因此,本研究針對(duì)人 bcl-2基因序列設(shè)計(jì) 3個(gè) siRNA靶點(diǎn)構(gòu)建 shRN A慢病毒表達(dá)載體,擬通過(guò)封閉和下調(diào) bcl-2基因的表達(dá),促進(jìn)其對(duì)放、化療的敏感性及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡,以達(dá)到腫瘤基因治療的實(shí)驗(yàn)研究目的,為今后臨床腫瘤治療提供一種新的途徑和方法。

材料與方法

1 材 料 主要試劑:帶紅色熒光報(bào)告基因pMAG(5.0)慢病毒載體(sb);E.coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞 (本 室 自 制 );Age I、EcoR I及 T4 DN A ligase(TaKaRa);PCR擴(kuò)增試劑盒(Fermentas);質(zhì)粒提取試劑盒(Promega);瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒(Promega)。主要儀器:核酸電泳儀(Amersham);PCR擴(kuò)增儀(ABI 9700型);凝膠成像分析系統(tǒng)(USA);恒溫培養(yǎng)箱(Thermo);恒溫?fù)u床(Fuma);臺(tái)式低溫高速離心機(jī)(Sigma)

2 方 法 ①si RNA靶序列設(shè)計(jì):根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中人 bcl-2序列 (NM-000633),選取 3個(gè)長(zhǎng)度為 21bp的特異性寡核苷酸作為靶序列,編號(hào)為PLV T-240(CCGGGAGAT AGTGATGAAGTA);PLV T-241(GTGATGAAGTACATCCAT TAT);PLV T-242(T GGATGACT GAGT ACCTGAAC);選取其中一個(gè)序列打亂并無(wú)基因同源性作為陰性對(duì)照序列:PLVT-5(GGAGTACGGT AAGTAGAGTGA)。②病毒載體構(gòu)建框架:以特異性寡核苷酸靶序列為摸板,按堿基互補(bǔ)配對(duì)原理,在兩互補(bǔ)鏈之間設(shè) CTCGAG作為 Loop環(huán)區(qū),后接 T T TT TTG轉(zhuǎn)錄終止信號(hào),5'端引入 Age I酶切位點(diǎn),3'端引入 EcoR I酶切位點(diǎn)。按每個(gè)靶序列設(shè)計(jì)合成正、反義兩條鏈組成特異性寡核苷酸鏈。 PLV T240正義鏈:5'-CCGGCCG GGAGATAGTGATGAAGT ACTCGAGT ACTTCA TCACTATCTCCCGGT TT TT Tg-3'反義鏈:5'-AAT TCAAAAAA CCGGGAGAT AGTGATGAAGTAC TCGAGT ACTTCATCACTATCTCCCGG-3'PLVT 241正義鏈):5'-CCGGGTGATGAAGT ACATCCAT T ATCTCGAGAT AATGGATGT ACT TCATCAC T T T TT Tg-3';反義鏈:5'-AATTCAAAAAAGTGAT GAAGTACATCCATT ATCTCGAGATAATGGAT GT ACTTCATCAC-3';PLV T242正義鏈:5'-CCGGT GGATGACTGAGTACCTGACCTCGAGAGT TCA GGTACTCAGTCATCCA T T TT TTg-3';反義鏈:5'-AATTCAAAAA TGGATGACTGAGT ACCT GA ACCTCAGAGGTTCAGGTACTCAGTCATCCA-3';PLV T5正義鏈:5'-CCGGGGAGTACGGTAAG T AGAGTGACTCGAGTCACTCTACT T ACCGT A CTCC T TT TT Tg-3';反義鏈:5,-AATTCAAAAAA GGAGTACGGT AAGTAGAGTGACTCGAGTCACT CT ACTT ACCGT ACTCC-3。 ③ DNA片段合成:將oligo用 oligo annealing buffer溶解成 20 μ M,互補(bǔ)單鏈各取 30 μ l混合,然后將 oligo混合物置 95℃水浴中加熱 5min,取出冷卻至室溫,形成雙鏈 oligo片段。取1 μ l用于后續(xù)連接反應(yīng),其余-20℃保存。④干擾片段連接入表達(dá)載體:用 Age I和 EcoR I雙酶切 pM AGi質(zhì)粒載體使其線性化,酶切產(chǎn)物電泳后回收約 7.48kb的載體片段。將退火的雙鏈 oligo與線性化干擾載體連接,連接反應(yīng)體系設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組(已驗(yàn)證片段),自連對(duì)照組,連接組。陽(yáng)性對(duì)照組和連接組分別加 1 μ l退火雙鏈 oligo(10mM),自連對(duì)照組不加。 3 μl線性化干擾載體 (40ng/μ l),2 μ l 10× T4 DNA ligase Buffer,1 μ l T4 DNA ligase,加 ddH2O至 20 μ l體系 ,于 16℃連接過(guò)夜。⑤重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化:取一支感受態(tài)細(xì)胞(每管100 μ l,-80℃保存 )于冰上 ,待溶解后加入 10 μ l連接液 ,輕輕旋轉(zhuǎn)混勻內(nèi)容物,在冰中放置 30min。將 EP管置42℃水浴中熱激 90s。迅速將 EP管轉(zhuǎn)移到冰浴中,使細(xì)胞冷卻 3min。每管加 900 μ l LB培養(yǎng)液,置 37℃搖床上溫育 1h使細(xì)菌復(fù)蘇。將轉(zhuǎn)化菌液涂布于含氨芐青霉素的 LB瓊脂平板上。置于 37℃培養(yǎng)箱,16h。⑥陽(yáng)性克隆鑒定:挑取平板上生長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子重懸于 10 μ l LB培養(yǎng)液中,從中取 1 μ l做模板進(jìn)行菌落 PCR鑒定。設(shè)計(jì) PCR擴(kuò)增引物為 primer(+):hU6-F(T ACGAT ACAAGGCTGT TAGAGAG);primer(-):M AGic-R(CT ATT AATAACT AATGCATGGC)。 PCR反應(yīng)體系:13.7 μl H2O,2 μ l 10× Buffer(with Mg2+),1.6 μl dN TP(各 2.5mM),0.8 μ l primer(+)(10 μM),0.8 μl primer(-)(10 μ M),1 μ l Template,0.1 μ l Taq酶。 PCR循環(huán)反應(yīng)按以下條件進(jìn)行:94℃ 5min,(94℃ 30s、55℃30s、72℃ 30s)30cycle,72℃ 10min。 PCR產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳,重組載體做 DNA測(cè)序鑒定。

結(jié) 果

1 PCR產(chǎn)物鑒定 分別取 5 μ l擴(kuò)增產(chǎn)物,加 1 μl 6×上樣緩沖液混勻上樣,2.0%瓊脂糖凝膠;10v/cm;1× TBE;25min。結(jié)果陽(yáng)性克隆擴(kuò)增出 335bp條帶,陰性克隆擴(kuò)增出 298bp條帶,表明目的片段已插入載體中。 (見(jiàn)附圖 )。

附圖 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2 重組載體測(cè)序鑒定 將構(gòu)建的重組載體陽(yáng)性克隆送北京華大基因公司進(jìn)行 DNA測(cè)序分析,測(cè)序結(jié)果中顯示含有與設(shè)計(jì)相同的靶序列,表明 bcl-2慢病毒載體構(gòu)建成功。下列陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果分析中黃顏色并帶下畫(huà)線部分為設(shè)計(jì)的靶序列。PLVT240:T AGGGAATACT TTGACTGTAACACAAAGATA T TAGTACAAAATACGTGACGT AGAAAGT AAT AAT TTCTTGGGTAGT TTGCAGT TT TAAAAT T ATGT TT T AAAATGGACTATCATATGCT TACC GTAACT TGAAAGTAT T TCGATT TCT TGGCT T T ATAT ATCT TGTGGAAAGGACGAAACACCGG CCGGGAGAT AGTGATGAAGTAGT ACTCGAGT ACTTCATCACT ATCTCCCGGT TT T TTGT TAA AGAAT AT TT TGACTGTAACACAAAGAT ATT A GT ACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAAT AAT T TCT TGGGTAGTT TGCAGT:PLV T241:ATGGA T T ATT TGACTGT AACACAAAGAT AT TAGTAC AAAATACGTGACGTAGAAAGTAAT AAT TTCT T GGGT AGT TT GCAGT TT TAAAATT ACCGGGT GATGAAGT ACATCCATT ATCTCGAGAT AATG GATGT ACTTCATCACT TT TT TGTGT T TT AAA ATGGACT ATCAT ATGCT TACCGT AACTT GAA AGT ATT TCGAT TTCTTGGCTT TATAT ATCT T GTGGAAAGGACGAAACACCGGGTGATG。PLV T242:TGGGAATTGACTGTAACACAAAGATAT T AGTACAAAAT ACGT GACGT AGAAAGT AAT A ATT TCT TGGGT AGT T TGCAGT TT T AAAATT A T GTT TT AAAATGGACTATCATATGCTT ACCG T AACT TGAAAGTAT TTCGAT T TCT TGGCT TT ATAT ATCT TGTGGAAAGGACGAAACACCCCG GTGGATGACTGAGT ACCTGAACCTCGAGGTT CAGGTACTCAGTCATCCATT TT T TGGGTGGA T GACTACGTGACGT AG TGGATGACTG。PLVT 5:TACAAT ACGTGACGT AGAAGT AAT AATCT T GGT AGTGCAGT T TAAAT TAT GTT TAT GGAC T ATCATATGCT TAGT ACT TGAAAGT ATTCGA TCTT GCT T TAATGTACATGACTCCGGGGAGT ACGGTAAGTAGAGTGACTCGAGTCACTCT AC T T ACCGTACTCCTT TT TTGACATCTACGTAT T AGTCATCGCTATT ACCAT GGTGATGCGGT T T TGGCAGT ACATCAATGGGCGT GGAT AGCGG T TGT ACATGACCTT ATGGGACT TTCCTACT T GGCAGT。

討 論

近些年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)[3,4],一些小的雙鏈 RNA可以通過(guò)促使 m RNA的降解,并且高效特異性的阻斷體內(nèi)某種特定基因的表達(dá)。這種現(xiàn)象或過(guò)程被稱(chēng)為 RNA干擾 (RNA interference,RNAi)。因?yàn)?RNAi可以作為一種簡(jiǎn)單有效的替代基因敲除的工具,所以在功能基因組學(xué)研究方面以及基因治療等領(lǐng)域,許多研究學(xué)者應(yīng)用 RNA干擾通過(guò)抑制目的基因的表達(dá)來(lái)研究哺乳動(dòng)物基因產(chǎn)物功能的有力工具[5,6]。

隨著腫瘤分子生物學(xué)不斷深入研究和發(fā)展以及RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用,bcl-2基因已作為腫瘤基因診斷與治療的靶點(diǎn)。研究表明,腫瘤細(xì)胞中 bcl-2過(guò)量表達(dá)不僅與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān),而且使得腫瘤細(xì)胞耐藥性增加。因此,有研究報(bào)道[7,8]應(yīng)用反義寡核苷酸封閉 bcl-2基因的表達(dá),從而導(dǎo)致其耐藥性下降敏感性提高并促使腫瘤細(xì)胞凋亡。

由于體外合成反義寡核苷酸簡(jiǎn)便有效因而常被研究學(xué)者采用,但價(jià)格較貴且抑制時(shí)間短,通常不能用來(lái)進(jìn)行長(zhǎng)期的基因抑制研究是其的弱點(diǎn)所在。為此,本研究設(shè)計(jì)通過(guò)小干擾 RNA在體內(nèi)表達(dá)一個(gè)短發(fā)夾 RNA(shRNA),這種 shRNA包含兩個(gè)由一莖環(huán)序列分隔的反向重復(fù)序列,由 U6啟動(dòng)子控制,其中一個(gè)反向重復(fù)序列與目的基因互補(bǔ)。隨后 shRNA被加工成siRNA,能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中持續(xù)表達(dá) si RNA,從而降解目的基因 m RNA并抑制其表達(dá),達(dá)到持久抑制基因表達(dá)的目的?；蛞种频挠行院艽蟪潭热Q于目的基因序列的選擇,本研究針對(duì) bcl-2目的基因選取 3個(gè)長(zhǎng)度為 21nt的特異性寡核苷酸作為靶序列,設(shè)計(jì) 3個(gè) siRNA干擾靶點(diǎn),分別連接入經(jīng) Age I和 EcoR I雙酶切線性化的慢病毒質(zhì)粒載體中,經(jīng)過(guò) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后陽(yáng)性克隆得到 335bp條帶,陰性克隆得到 298 bp條帶,證明設(shè)計(jì)的序列片段已插入載體中,DNA測(cè)序結(jié)果證實(shí)其含有設(shè)計(jì)合成序列。結(jié)果表明,成功構(gòu)建了 shRNA表達(dá)載體。由于慢病毒載體能高效將目的基因或 RNAi導(dǎo)入動(dòng)物和人的原代細(xì)胞或細(xì)胞系。與腺病毒不同的是,慢病毒能將目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組中,并隨細(xì)胞基因組分裂而分裂。能有效感染并整合到非分裂細(xì)胞中。本研究中使用的是“第三代”慢病毒載體,因此具有較好的安全性、靶向性,并為下一步的實(shí)驗(yàn)研究打下良好基礎(chǔ)。

[1]Kok SH,Cheng SJ,HongCY,et al.Noreantharidininduced apopotosis in oral cancer cells is associated with an increase of proapoptotic to antiapoptotic protein ratio[J].Cancer Lett,2005,217(1):43-52.

[2]ArmstrongRC,AjaT,Xiang J,et al.Fas-induced activation of the cell death-related protease CPP32is inhibited by Bcl-2by ICE family protease inhibitors[J].Biol Chem,1996,271:16850-16855.

[3]Elbashir SM,Harborth J,Lendeckel W,et al.Duplexes of 21-nucleotide RN Asmediate RN A interference in cultured mammalian cells[J].Nature,2001,411(6836):494-498.

[4]Rye PD,Stigbrand T.Interfering with cancer:a brief outline of advances in RN A interference in Oncology[J].Tumour Biol,2004,25(5-6):329-336.

[5]Tusch IT,BorkhardtA.Small interfering RN As:arevolutionary tool for the analysis of gene function and gene therapy[J].Mol Intervent,2002,2(3):158-167.

[6]V erma N K,Dey CS.RNA-mediated gene silencing:mechanisms and its therapeutic applications[J].J Clin Pharm Ther,2004,29(5):395-404.

[7]Buck AC,Shen C,SchirrmeisterH,et al.Liposonal delivery of antisense oligonucleotidesfor efficient downregulation of Bcl-2 and induction of apoptosis[J].Cancer Biother Radiopharm,2002,17(3):281-289.

[8]Lima RT,Martins LM,Guimaraes JE,et al.Specifie downregulation of Bcl-2and xIAP by RN Ai enhances the effects of chemotherapeutic agentsin MCF-7human breast cancer cells[J].Cancer Gene Ther,2004,11(5):309-316.