鹽酸法舒地爾對(duì)大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)海馬神經(jīng)元的保護(hù)作用

耿 瑜，鄭輯英，李光來(lái)，薛國(guó)芳，郝慶偉

癲癇持續(xù)狀態(tài)（SE）是指連續(xù)癲癇發(fā)作持續(xù)30min或者在其兩次或者多次發(fā)作的間歇期意識(shí)沒(méi)有完全恢復(fù)的狀態(tài)。SE有很高的致殘率和致死率，探索新的更加有效的SE后神經(jīng)元保護(hù)方法有著重要臨床意義。鹽酸法舒地爾是一種異喹啉磺胺衍生物，主要是通過(guò)抑制Rho激酶發(fā)揮作用，具有擴(kuò)張血管、改善腦循環(huán)、減輕缺血損傷的作用。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察SE后大鼠腦組織凋亡相關(guān)基因XIAP、Caspase－9的表達(dá)情況，探討鹽酸法舒地爾干預(yù)對(duì)SE導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷的影響及其可能的機(jī)制，以期為鹽酸法舒地爾應(yīng)用于臨床SE的治療提供可能的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 健康成年Wistar大鼠54只，體重220g～240 g（山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），氯化鋰（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海制劑公司），匹羅卡品（美國(guó)Sigma公司），免疫組化試劑盒、DAB顯色劑及多聚賴(lài)氨酸、Caspase－9一抗（BA2216）、XIAP一抗（BA2621，武漢博士德生物有限公司），鹽酸法舒地爾（天津紅日醫(yī)藥有限公司）。

1.2 動(dòng)物分組及模型的建立 Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（A組）、模型組（B組）、鹽酸法舒地爾組（C組）。后兩組再隨機(jī)分為4個(gè)亞組：分別用于SE后6h、12h、24h和48h時(shí)點(diǎn)。采用國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的氯化鋰－匹羅卡品癲癇持續(xù)狀態(tài)動(dòng)物模型：按體重127mg/kg，18h后經(jīng)腹腔注射新鮮配制的匹羅卡品30mg/kg。造模成功后所有大鼠隨機(jī)分為模型組、鹽酸法舒地爾組。鹽酸法舒地爾組于達(dá)癲癇持續(xù)狀態(tài)1h后采用腹腔注射給藥50mg/kg，模型組和對(duì)照組1h后腹腔注射等量生理鹽水。驚厥評(píng)分采用Racine評(píng)分法，癇性發(fā)作行為分級(jí)6級(jí)。癇性發(fā)作持續(xù)超過(guò)30 min為SE。在SE達(dá)1h時(shí)，予腹腔注射地西泮10mg/kg，終止癇性發(fā)作。

1.3 標(biāo)本處理 在SE后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)各取大鼠6只，用25%烏拉坦4mL/kg深麻醉后，斷頭取腦，大鼠腦組織置入4%多聚甲醛中固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋后，在視交叉后海馬區(qū)連續(xù)冠狀切片，每片厚5μm。HE染色，光鏡下觀察形態(tài)學(xué)變化。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用原位缺口末端標(biāo)記法（TUNEL法）檢測(cè)，按試劑盒（POD）提供方法操作，細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野下的凋亡細(xì)胞數(shù)，凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）以凋亡細(xì)胞/100個(gè)細(xì)胞表示。

1.5 免疫組化檢測(cè) 采用SP法，染色步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。顯微鏡下胞漿或胞核有棕色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，每只動(dòng)物隨機(jī)取3張切片，每張切片在400倍視野下隨機(jī)選取不重疊的5個(gè)視野，圖像輸入計(jì)算機(jī)，采用彩色圖像分析系統(tǒng)，分別計(jì)數(shù)XIAP和Caspase－9染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取均數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)表現(xiàn) B組大鼠注射匹羅卡品后15min～30min均出現(xiàn)流涎、點(diǎn)頭、洗臉樣動(dòng)作；隨后出現(xiàn)前肢陣攣，之后很快表現(xiàn)為前肢陣攣伴站立，進(jìn)一步發(fā)展到全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作伴站立、摔倒，反復(fù)發(fā)作，均達(dá)到Ⅳ級(jí)～Ⅴ級(jí)發(fā)作，呈癲癇持續(xù)狀態(tài)，點(diǎn)燃率為100%。C組大鼠也均達(dá)到癲癇持續(xù)狀態(tài)，但潛伏期較長(zhǎng)且癇性發(fā)作程度較B組輕，多在Ⅲ級(jí)～Ⅳ級(jí)發(fā)作。A組大鼠無(wú)癲癇發(fā)作。

2.2 TUNEL檢測(cè)結(jié)果 A組僅有少量TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，呈散在分布，著色較淺。B組6hTUNEL陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)開(kāi)始增多，并隨時(shí)間點(diǎn)的延長(zhǎng)而增加，24h達(dá)高峰，48h減少，與B組相比，C組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞也是在24h達(dá)高峰，但相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)均低于B組（P＜0.0 5或P＜0.01）。詳見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠SE后海馬TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（±s）

表1 3組大鼠SE后海馬TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（±s）

組別6h 12h 24h 48h A組1.87±0.26 B組 14.93±1.03 28.53±1.37 36.61±1.38 28.35±1.20 C組 13.30±1.22 17.66±1.16 27.49±1.34 19.83±1.12 P＜0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.3 AP和Caspase－9檢測(cè) A組大鼠海馬未見(jiàn)XIAP和Caspase－9陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)。B組6h有大量XIAP和Caspase－9陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)，12h到達(dá)高峰；C組與B組相比，各時(shí)間點(diǎn)XIAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著增加（P＜0.05），Caspase－9陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著減少（P＜0.05）。詳見(jiàn)表2、表3。

表2 B組與C組大鼠SE后海馬XIAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（±s）

表2 B組與C組大鼠SE后海馬XIAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（±s）

組別6h 12h 24h 48h B組 13.28±6.47 22.12±7.25 15.97±8.12 10.51±4.31 C組 24.51±9.07 39.30±12.94 22.77±12.23 19.99±4.42 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

表3 3組大鼠SE后海馬Caspase－9陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（±s）

表3 3組大鼠SE后海馬Caspase－9陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（±s）

組別6h 12h 24h 48h B 組 34.92±10.77 54.01±14.11 41.35±10.59 38.85±9.76 C組 20.58±7.53 36.37±12.57 28.07±7.37 20.13±9.08 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 討 論

目前認(rèn)為至少有三條信號(hào)通路參與細(xì)胞的凋亡：線粒體通路、死亡受體通路、內(nèi)皮網(wǎng)通路。Caspase是細(xì)胞凋亡的核心，在這三條凋亡通路中幾乎涉及Caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)［1］。凋亡過(guò)程可劃分為啟動(dòng)、效應(yīng)、降解3個(gè)功能截然不同的階段，而Caspase－9是最主要的凋亡啟動(dòng)分子，是線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵蛋白酶，處于Caspase“瀑布式”的頂端，它可以啟動(dòng)Caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并激活下游的Caspase－3，從而完成對(duì)其相應(yīng)底物的切割，引起細(xì)胞凋亡［2］。

XIAP是一種細(xì)胞內(nèi)源性的抗凋亡蛋白，屬于凋亡抑制蛋白家族（IAPs）。而XIAP是該家族中結(jié)構(gòu)最典型、作用最強(qiáng)、功能最全面的Caspase抑制因子。它含有三個(gè)結(jié)構(gòu)域：BIR、RING和CARD，其中特征性功能結(jié)構(gòu)為氨基端的3個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域：BIR1、BIR2和BIR3。XIAP主要通過(guò)BIR3結(jié)構(gòu)域與Caspase－9單體相結(jié)合，形成異源性二聚體，使Caspase－9失去單體結(jié)構(gòu)而喪失其催化活性，當(dāng)BIR3結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變后，XIAP將會(huì)失去對(duì)Caspase－9的抑制作用。

鹽酸法舒地爾是一種Rho激酶（ROCK）特異性抑制劑，起初認(rèn)為其僅是一種細(xì)胞內(nèi)鈣離子拮抗劑，可以抑制蛋白激酶A/C/G和肌球蛋白輕鏈激酶，從而使血管平滑肌舒張、血管擴(kuò)張［3］。腦缺血后缺血神經(jīng)元軸突內(nèi)ROCK蛋白表達(dá)增加、活性增強(qiáng)［4－6］，鹽酸法舒地爾不僅可以通過(guò)以上的作用機(jī)制來(lái)緩解腦缺血癥狀，還可以通過(guò)直接作用于受損的神經(jīng)元而發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)研究表明，預(yù)先給予鹽酸法舒地爾不僅能延遲SE出現(xiàn)的時(shí)間，并且能減輕癲癇發(fā)作級(jí)別以及神經(jīng)元的損傷程度；鹽酸法舒地爾可能是通過(guò)上調(diào)SE大鼠腦組織XIAP的表達(dá)而抑制Caspase－9產(chǎn)生，從而發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。

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