PCR-DGGE實(shí)驗(yàn)技術(shù)在畜牧科學(xué)研究中的應(yīng)用

浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院 李曉燕 肖英平 洪奇華 陳安國＊

變性梯度凝膠電泳 （denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技術(shù)是1979年由Fischer和Lerman提出用于檢測DNA突變的一種電泳技術(shù)。Muzyer等（1993）將DGGE實(shí)驗(yàn)技術(shù)應(yīng)用于土壤微生物區(qū)系的研究，并證實(shí)該技術(shù)在研究自然界微生物群落的遺傳多樣性和種群差異方面具有明顯的優(yōu)越性。近年來變性梯度凝膠電泳技術(shù)已得到迅速發(fā)展，被普遍應(yīng)用于動物及人體微生物生態(tài)區(qū)系的研究（Pang等，2005）。隨著畜牧科學(xué)的發(fā)展，DGGE結(jié)合PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)也廣泛應(yīng)用于動物科學(xué)研究中（何濤等，2008；吳高鋒等，2008）。本文就PCR-DGGE技術(shù)的基本原理、實(shí)驗(yàn)流程，優(yōu)缺點(diǎn)及其在畜牧科學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)行概述。

1PCR-DGGE實(shí)驗(yàn)技術(shù)基本原理及流程

DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)是氫鍵和堿基的疏水作用共同作用的結(jié)果，溫度、有機(jī)溶劑和pH等因素都可以使氫鍵受到破壞，導(dǎo)致雙鏈變性為單鏈。變性梯度凝膠電泳技術(shù)是根據(jù)DNA在梯度變性膠中具有的解鏈特性，不同序列的DNA片段進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)在各自相應(yīng)的變性劑濃度（由尿素和甲酰胺組成的變性劑的濃度呈梯度上升）下變性從而分離。用PCR-DGGE技術(shù)研究微生物群落結(jié)構(gòu)時(shí)，從混合菌群中提取總DNA，通過PCR擴(kuò)增出細(xì)菌16S rDNA或18S rDNA基因的部分序列，得到片段大小相同但序列不同的目的片段混合物，在變性凝膠中進(jìn)行電泳，雙鏈DNA序列遷移到變性凝膠的一定位置并達(dá)到其解鏈溫度時(shí)，即開始部分解鏈，解鏈程度越大，遷移阻力越大，DNA分子的遷移速度隨之減小，當(dāng)產(chǎn)生的遷移阻力與電場力相平衡時(shí)，具有不同序列的DNA片段就停留在凝膠的不同位置，形成相互分開的條帶圖譜 （何濤等，2008；王凱，2007；Holben等，1998）。理論上只要選擇足夠精細(xì)的電泳條件，最低可檢測到只有一個(gè)堿基差異的DNA片段（王凱等，2007），為了提高DGGE的檢測敏感性，通常在一側(cè)引物的5′端設(shè)計(jì)增加一個(gè)“GC夾板”（GC-Clamp，30 ～ 50 bp）（Holben 等，1998），電泳條帶的數(shù)目和密度可分別反映細(xì)菌種類的多少和細(xì)菌的相對構(gòu)成比例，對條帶DNA進(jìn)行分析即可獲得微生物信息（Nakatsu，2007）。DGGE實(shí)驗(yàn)流程方式見圖1。

2 PCR-DGGE實(shí)驗(yàn)技術(shù)在研究微生物菌群上的優(yōu)勢與局限性

圖1 DGGE方法工作流程

在DNA分子技術(shù)出現(xiàn)之前，人們對腸道微生物的研究大多數(shù)是通過純培養(yǎng)或直接形態(tài)觀察，但是由于微生物形態(tài)簡單不能提供太多的信息，并且腸道內(nèi)微生物很多都是厭氧菌，只有少部分微生物能夠被分離培養(yǎng)，若以這部分微生物來代表腸道中復(fù)雜的微生物菌群將導(dǎo)致很大的偏差（吳高鋒等，2008）。PCR-DGGE實(shí)驗(yàn)技術(shù)可以很好地解決這一問題，它無需培養(yǎng)，故不受培養(yǎng)基的影響；不僅適用于通過普通培養(yǎng)方法得到的微生物，還能夠分離到難以或無法用常規(guī)方法培養(yǎng)的微生物群落，以及混合微生物群落中含量很低的DNA序列；并且具有可靠、可重復(fù)、快速和易操作等特點(diǎn)（何濤等，2008）。若進(jìn)一步將凝膠上的條帶切割下來進(jìn)行測序分析，與GenBank中的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比較，便可以得出它們的遺傳相關(guān)性。

PCR-DGGE技術(shù)也有自身的局限性，一是不能完整地體現(xiàn)全部的微生物群落，只能檢測占整個(gè)群落微生物數(shù)量不低于1%的優(yōu)勢菌群（Omar和 Ampe，2000；Muzyer等，1997）； 二是無法確定分離的DNA片段在何位置發(fā)生的突變，也不能確定分離的DNA屬于何種微生物，還需借助DNA測序分析；三是只能分離較小的片段 （最長只達(dá)l000 bp），這些序列只能提供有限的信息，片段太長時(shí)解離率下降，限制了用于系統(tǒng)發(fā)育分析和探針的序列信息量 （Nakatsu，2007； 吳高 鋒等 ，2008）。

3 PCR-DGGE實(shí)驗(yàn)技術(shù)在畜牧研究中的應(yīng)用

PCR-DGGE實(shí)驗(yàn)技術(shù)在畜牧科學(xué)研究的應(yīng)用主要集中在對腸道及瘤胃微生物的分析，主要包括六方面：（1）飼料成分對腸道、瘤胃微生物結(jié)構(gòu)及功能的影響；（2）抗生素或者益生素對腸道、瘤胃微生物結(jié)構(gòu)及功能的影響；（3）環(huán)境應(yīng)激等因素對腸道、瘤胃微生物結(jié)構(gòu)及功能的影響；（4）動物不同發(fā)育階段腸道、瘤胃微生物結(jié)構(gòu)及功能的影響；（5）不同品種間腸道、瘤胃微生物的比較分析；（6）瘤胃細(xì)菌的遺傳多樣性分析。

3.1 PCR-DGGE實(shí)驗(yàn)技術(shù)在單胃動物研究中的應(yīng)用

3.1.1 監(jiān)測腸道菌落的動態(tài)性變化 動物日糧作為微生物最終代謝底物的來源，其成分和營養(yǎng)濃度的變化對微生物菌群的數(shù)量及多樣性具有顯著影響。Hume等（2003）采用PCR-DGGE技術(shù)研究了生長期和換羽期雞腸道內(nèi)微生物菌群變化的影響，結(jié)果表明，大于20日齡與小于20日齡的小雞盲腸微生物菌群的相似性為51%，換羽和未換羽雞盲腸微生物菌群的相似性為40%，并且發(fā)現(xiàn)低鈣日糧或高鋅日糧會降低雞盲腸微生物的多樣性。Zhou等（2007）研究不同劑量的維及霉素和亞甲基雙水楊酸桿菌肽 （BMD）對不同日齡（3、7、14 d）的肉雞腸道微生物的影響，結(jié)果表明，用抗生素處理的3日齡肉雞回腸腸道球菌比未用抗生素處理的肉雞豐富；乳酸桿菌的數(shù)量在3日齡和7日齡較少，而在14日齡顯著增加；22 mg/kg的維及霉素對乳酸桿菌有抑制作用；預(yù)防性劑量的BMD對3日齡和7日齡肉雞腸道乳酸桿菌均有抑制作用，對14日齡肉雞腸道乳酸桿菌抑制作用不明顯。胡平等（2010）研究不同形態(tài)玉米日糧對鵝腸道微生物區(qū)系的影響，玉米形態(tài)，尤其是整粒玉米日糧能夠影響鵝腸道菌群分布，其中對空腸和回腸影響較大，對直腸的影響次之，對十二指腸和盲腸影響較小。

朱偉云等（2003）利用PCR-DGGE技術(shù)研究了仔豬斷奶前后腸道和糞樣微生物區(qū)系組成的變化，結(jié)果表明，仔豬斷奶當(dāng)天腸道和糞樣DGGE譜帶少，同窩仔豬間圖譜相似，斷奶后的DGGE圖譜帶逐漸增多，仔豬個(gè)體間DGGE圖譜差異增大，仔豬是否同窩對DGGE圖譜無顯著影響；斷奶后多樣性指數(shù)較斷奶前明顯增加，而后微生物區(qū)系趨于多樣且穩(wěn)定。吳超等（2010）在早期斷奶仔豬日糧中添加不同比例的中草藥復(fù)方制劑，腸道菌群DGGE圖譜顯示中草藥處理的仔豬直腸糞樣相似性指數(shù)大于60%，0.5%中草藥組仔豬微生物多樣性最高；并通過DGGE圖譜上的特異性條帶發(fā)現(xiàn)有益菌的存在，說明復(fù)方中草藥可以促進(jìn)有益菌的生長，有效地改善斷奶仔豬腸道微生物區(qū)系，進(jìn)而有效降低腹瀉率，減少應(yīng)激反應(yīng)。毛倩等（2010）在研究飼糧中添加復(fù)合益生素（Js菌0.1%和0.2%）對生長育肥豬盲腸菌群影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，添加Js菌趨于增加盲腸內(nèi)容物乳酸桿菌數(shù)量，減少大腸桿菌數(shù)量（P＞0.05），DGGE圖譜相似性分析能反映樣品間菌群相似度，抗生素組與對照組盲腸內(nèi)容物菌群相似性較高 （相似性約85%），而添加JS的兩組與二者相似性較低（相似性約57%），說明添加JS菌可使菌群種類和數(shù)量發(fā)生一定變化。

3.1.2 分析腸道菌群的多樣性 研究比較不同品種、不同腸段間腸道微生物多樣性差異常采用PCR-DGGE技術(shù)。曾志光等 （2010）采用PCRDGGE指紋圖譜技術(shù)研究相同生長環(huán)境中不同品種豬腸道微生物群落差異與品種的關(guān)系，分析了榮昌豬、長白、杜洛克豬糞樣中腸道微生物群落多樣性，結(jié)果表明，榮昌豬腸道微生物群落多樣性最高，榮昌豬與杜洛克豬的腸道微生物群落差異為37.3%，與長白豬的腸道微生物群落差異為31.8%。倪學(xué)勤等（2008）對不同周齡蛋雞嗉囊，十二指腸、空腸、回腸和盲腸內(nèi)容物細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行了比較，腸道菌群DGGE圖譜顯示腸道部位對細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)影響很大，盲腸內(nèi)微生物的多樣性最高，其次是回腸和空腸，嗦囊和十二指腸的微生物多樣性比較低；十二指腸內(nèi)細(xì)菌與其他腸段相比差異最大，其次是盲腸。王金全等（2005）采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)和PCR-DGGE兩種方法，針對肉仔雞玉米-豆粕型、小麥-豆粕型和添加木聚糖酶的小麥-豆粕型3種日糧腸道內(nèi)微生物數(shù)量和優(yōu)勢菌的多樣性進(jìn)行研究，小麥非淀粉多糖改變了腸道內(nèi)微生物的種群結(jié)構(gòu)，降低了菌群種屬的數(shù)量（P＜0.05），添加木聚糖酶對回腸和盲腸的微生物種類以及菌群數(shù)量無顯著影響（P ＞ 0.05）。

3.2 PCR-DGGE實(shí)驗(yàn)技術(shù)在反芻動物研究上的應(yīng)用 Kocherginskaya等（2001）率先將 DGGE技術(shù)應(yīng)用于瘤胃細(xì)菌群體結(jié)構(gòu)的研究，分析了飼喂兩種不同日糧的閹公牛瘤胃液樣品的DGGE圖譜，發(fā)現(xiàn)飼喂兩種不同日糧的動物的DGGE圖譜間存在顯著差異。Belanche（2010）用DGGE凝膠電泳結(jié)合定量PCR來研究瘤胃微生物區(qū)系生物多樣性的發(fā)展，監(jiān)測羔羊在強(qiáng)飼的條件下生長的三個(gè)階段哺乳期（30 d）、斷奶期（45 d）和育肥期（90 d）網(wǎng)胃瘤胃微生物數(shù)量，在哺乳期30 d后纖維分解細(xì)菌數(shù)量明顯增加，45 d和90 d后，生黃瘤胃球菌的數(shù)量減少而白色瘤胃球菌數(shù)量增加；原蟲變化不規(guī)律，哺乳期有大量的內(nèi)纖毛蟲屬微生物，但在斷奶期消失。Kittelmann和Janssen（2011）使用PCR-DGGE等技術(shù)比較季節(jié)性日糧變化對新西蘭家養(yǎng)羊、鹿和牛瘤胃中纖毛蟲菌落組成的影響，不同的反芻動物飼喂相同飼料瘤胃的纖毛蟲菌落變異程度呈現(xiàn)很大差異，羊的多樣性指數(shù)最高，紅鹿其次，牛最低；進(jìn)一步的試驗(yàn)是由家畜自由采食改為集中飼喂青貯飼料和濃縮料，試驗(yàn)結(jié)果與前面一致；對于連續(xù)變化日糧的應(yīng)激，牛的瘤胃纖毛蟲菌落多樣性表現(xiàn)得較為穩(wěn)定，而羊和紅鹿纖毛蟲菌落組成變化較大。

王新峰等（2010）研究低聚異麥芽糖（IMO）和低聚果糖（FOS）對斷奶羔羊瘤胃菌群的影響，采用DGGE技術(shù)對羔羊瘤胃內(nèi)容物細(xì)菌16S rRNA的V6-V8可變區(qū)進(jìn)行菌群多樣性分析，并用實(shí)時(shí)定量PCR對細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明，F(xiàn)OS顯著降低了瘤胃菌群的多樣性（P＜0.05），而IMO及混合低聚糖對瘤胃菌群的多樣性無顯著影響 （P＞0.05），兩種低聚糖均顯著降低DGGE凝膠上的條帶數(shù)（P＜0.05），說明低聚糖能改變斷奶羔羊瘤胃菌群多樣性。劉圓圓（2010）通過變性梯度凝膠電泳分析水牛瘤胃產(chǎn)甲烷古菌的多樣性，并對凝膠上不同水平位置的優(yōu)勢條帶進(jìn)行克隆測序，所得序列其中3條和甲烷短桿菌同源性達(dá)99%，1條與甲烷短桿菌同源性達(dá)98%，4條與古菌序列存在一定相似性。

采用PCR-DGGE技術(shù)分析不同的飼料處理方法對犢牛瘤胃細(xì)菌區(qū)系產(chǎn)生影響，在玉米和大豆經(jīng)過膨化（PCON）、蒸汽壓片（SFCS）及常規(guī)粉碎（對照組，NCON）的加工方式處理后，3組犢牛瘤胃中的細(xì)菌種群隨年齡增長的組成情況基本一致，但SFCS組犢牛瘤胃中細(xì)菌的組成較其他2組相對復(fù)雜，反應(yīng)蒸汽壓片處理有助于犢牛瘤胃的發(fā)酵和發(fā)育（張?jiān)獞c等，2010）。

3.3 PCR-DGGE實(shí)驗(yàn)技術(shù)在飼料生產(chǎn)研究上的應(yīng)用 PCR-DGGE技術(shù)可用來監(jiān)測微生物發(fā)酵原棉籽粕脫毒的過程，鑒定提取的DNA質(zhì)量。湯江武等（2010）建立了一種以溶菌酶-SDS-蛋白酶K裂解棉籽粕發(fā)酵樣品從中直接提取DNA的方法，通過對以本實(shí)驗(yàn)提取獲得的DNA為模板擴(kuò)增的16S rRNA-V3區(qū)產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析，DGGE圖譜中不同條帶代表不同的細(xì)菌，條帶的亮度表示該細(xì)菌的相對豐度，可以顯示棉籽粕發(fā)酵過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

青貯飼料是反芻動物最重要的粗飼料之一，青貯的質(zhì)量直接由青貯發(fā)酵的成功與否決定，所以了解青貯的發(fā)酵本質(zhì)至關(guān)重要，一些學(xué)者開始應(yīng)用分子生物學(xué)手段研究青貯中的乳酸菌。馬俊孝（2006）利用PCR-DGGE在青貯中發(fā)現(xiàn)了植物乳桿菌 （Lactobacillus plantarum）和乳鏈球菌（Streptococcus lactis）。 韓吉雨等（2009a、b）利用V3區(qū)細(xì)菌通用引物對玉米青貯和苜蓿青貯不同發(fā)酵階段進(jìn)行PCR-DGGE分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苜蓿青貯各個(gè)時(shí)間點(diǎn)菌群變化不明顯，玉米青貯0～3 d和7～60 d菌群由多急劇變少，兩個(gè)階段相似性小于50%；而利用引物（P2f和P3r）同樣對玉米青貯和苜蓿青貯不同發(fā)酵階段進(jìn)行PCRDGGE分析，結(jié)果表明，苜蓿和玉米青貯兩個(gè)發(fā)酵階段菌群結(jié)構(gòu)相似。雖然設(shè)計(jì)引物的不同導(dǎo)致結(jié)果不同，但是該研究表明了PCR-DGGE在監(jiān)測飼料加工過程微生物變化中的重要作用。

4 小結(jié)與應(yīng)用前景

從目前的發(fā)展趨勢可以看出，分子生物學(xué)技術(shù)正逐步取代某些傳統(tǒng)的研究方法而被廣泛應(yīng)用于微生物研究，而PCR-DGGE技術(shù)必將成為評價(jià)群體微生物種群結(jié)構(gòu)和動態(tài)差異的有利技術(shù)手段，為了減少各種生物技術(shù)的偏差和局限性，DGGE還可以與其他方法結(jié)合起來，如糖和發(fā)酵產(chǎn)物分析、雜交技術(shù)、測序技術(shù)等。目前國內(nèi)應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)對腸道、瘤胃微生物，尤其是體外培養(yǎng)微生物的研究還處于初期階段，應(yīng)大力拓展DGGE技術(shù)應(yīng)用范圍，結(jié)合PCR、RT-PCR等其他分子生物學(xué)技術(shù)及微生物學(xué)方法，更準(zhǔn)確地揭示微生物的多樣性和開發(fā)更多的未知微生物遺傳資源。

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