抗氯霉素單鏈抗體基因工程菌表達(dá)條件優(yōu)化

四川理工學(xué)院 邊名鴻 左 勇 陳欲云

氯霉素（CAP）是一種高效廣譜的抗生素，在各種動物傳染性疾病的防治方面得到了廣泛的應(yīng)用。但是其具有嚴(yán)重的毒副作用，長期微量攝入氯霉素不僅會使大腸桿菌、沙門氏菌等多種菌株產(chǎn)生耐藥性，而且會引起動物機體正常菌群失調(diào)，抵抗力降低，易感染各種疾?。ㄔx等，2008）。氯霉素在食用動物中的殘留，可通過食物鏈在人體中富集，能引起人類的再生障礙性貧血、粒狀白細(xì)胞缺乏癥等疾病，因此，氯霉素在動物性食品中的殘留對人類的健康構(gòu)成了潛在危害。歐盟、美國等發(fā)達(dá)國家相繼禁止或嚴(yán)格限制使用氯霉素。我國農(nóng)業(yè)部也已禁止使用該藥（滑靜等，2003）。但由于氯霉素抑菌效果好，價格低廉，常被違法使用。因此，探索靈敏、高效、快速的氯霉素殘留檢測方法具有現(xiàn)實意義。

酶聯(lián)免疫測定法（ELISA）作為一種食品中殘留藥物的檢測技術(shù)，因其較好的敏感性和特異性，廣泛應(yīng)用于氯霉素殘留檢測上，國外已將此方法的試劑盒商品化。目前我國用于氯霉素殘留檢測的ELISA試劑主要來源于進口，價格比較昂貴，國內(nèi)雖有一些采取雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)抗氯霉素單克隆抗體的方法，但普遍存在著生產(chǎn)規(guī)模小、質(zhì)量不穩(wěn)定、生產(chǎn)成本高和難于放大生產(chǎn)等問題?；蚬こ虇捂溈贵w分子質(zhì)量小，制備方法簡單，能夠通過基因改造來增強其親和力和特異性，特別是易于放大生產(chǎn) （沈倍奮等，2005），將其應(yīng)用于ELISA檢測中，則可以解決目前ELISA應(yīng)用中的眾多問題。本論文研究了基因重組單鏈抗體高效表達(dá)的影響因素，為下一步的研究和生產(chǎn)提供條件。

1 試劑與方法

1.1 實驗儀器與試劑

1.1.1 實驗儀器 SW-CJ-IF型凈化工作臺 （蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；THZ-051型高精度數(shù) 控 搖 床 （SHENRGY BIOCOZOR公 司 ）；D-37520型臺式冷凍高速離心機 （Thermo公司）；垂直板電泳槽、恒流電泳儀、凝膠掃描分析系統(tǒng)（上海天能有限公司）。

1.1.2 實驗菌株和培養(yǎng)基 抗CAP單鏈抗體工程菌BL21菌株，本實驗室保存。

LB培養(yǎng)基：0.5%胰蛋白胨，0.5%酵母抽提物，1% 氯化鈉。

1.1.3 試劑 Tris、HCl、IPTG、SDS、 丙烯酰胺、EDTA、β-巰基乙醇、N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺、過硫酸銨、TEMED、溴酚藍(lán)、甘氨酸、NaCl、NaAc 等均購自廣州威佳科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 生長曲線的繪制 取保存菌種，以1%的接種量接種在2 mL的試管培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min活化過夜。第2天以1%的接種量接種在100 mL的三角瓶培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min進行培養(yǎng)， 分別在 0、1、2、3、4、5、6、7 h 取 1 mL 培養(yǎng)液，用可見光分光光度計測OD600。以時間為橫坐標(biāo)、OD600為縱坐標(biāo)，繪制工程菌的生長曲線。

1.2.2 誘導(dǎo)物的優(yōu)化 取保存菌種，以1%的接種量接種在2 mL的試管培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min活化過夜。第2天以1%的接種量接種在100 mL的三角瓶培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min培養(yǎng)3 h后，分別加入IPTG、乳糖、別乳糖進行誘導(dǎo)，4 h后停止培養(yǎng)。各取100 μL菌液，5000 r/min離心5 min，棄上清。分別加入100 μL 2×上樣緩沖液，100℃沸水浴煮沸5 min，12000 r/min離心5 min，取上清進行垂直板電泳。

1.2.3 誘導(dǎo)時機的優(yōu)化 取保存菌種，以1%的接種量接種在2 mL的試管培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min活化過夜。第2天以1%的接種量接種在100 mL的三角瓶培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min分別培養(yǎng)至1.5、3、4.5 h時，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），均誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h后停止。各取100 μL菌液，處理方法與1.2.2中相同，進行SDS-PAGE檢測。

1.2.4 誘導(dǎo)時間的優(yōu)化 取保存菌種，以1%的接種量接種在2 mL的試管培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min活化過夜。第2天以1%的接種量接種在100 mL的三角瓶培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min培養(yǎng)至3 h加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。從誘導(dǎo)0 h開始，分別在誘導(dǎo) 1、2、3、4、5 h 取樣， 每次取 100 μL 菌液，處理方法與1.2.2中相同，進行SDS-PAGE檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 工程菌的生長曲線 在100 mL的三角瓶培養(yǎng)基中，工程菌在37℃，200 r/min的條件下生長，其OD600隨時間變化如表1。

表1 工程菌生長的OD600變化

以時間為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)繪制的生長曲線如圖1。

圖1 工程菌生長曲線

由圖1可以看出，工程菌的生長規(guī)律在1.5 h進入對數(shù)生長早期，3 h進入對數(shù)生長中期，4.5 h進入對數(shù)生長末期，6 h開始進入穩(wěn)定期了。

2.2 誘導(dǎo)物的優(yōu)化 對于構(gòu)建的抗CAP單鏈抗體基因工程菌BL21，使用三種誘導(dǎo)物進行誘導(dǎo)表達(dá)后，與空白宿主菌比較，在分子質(zhì)量大約為28 kD處均有一新增條帶，如圖2所示。此大小與抗CAP單鏈抗體的理論大小相一致，判斷為單鏈抗體目的蛋白。從圖2中可以看出，在其他條件相同的情況下，三種誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)效果不同，使用IPTG作誘導(dǎo)劑，外源蛋白的表達(dá)量最高，掃描顯示高達(dá)45%，其他兩種誘導(dǎo)物的表達(dá)量分別為25%和35%，相比較IPTG的效果較好。

2.3 誘導(dǎo)時機的優(yōu)化 基因工程菌生長和外源蛋白的表達(dá)是一種矛盾，外源蛋白的表達(dá)會影響工程菌自身的生長，所以選擇合適的誘導(dǎo)時機對獲得高的產(chǎn)量具有重要的意義。結(jié)合表2和圖3中可以看出，培養(yǎng)3 h進行誘導(dǎo)，外源蛋白的表達(dá)量掃描顯示達(dá)43%，菌體的生物量OD600值為4.010；培養(yǎng)1.5 h進行誘導(dǎo)，外源蛋白的表達(dá)量掃描顯示高達(dá)52%，菌體的生物量OD600值為3.212；培養(yǎng)4.5 h進行誘導(dǎo)，菌體的OD600值為4.450，外源蛋白的表達(dá)量掃描顯示只有33%。外源蛋白的總產(chǎn)量既與外源蛋白表達(dá)的百分比有關(guān)，也與工程菌的生物量有關(guān)，需從相乘的角度綜合考慮，因此選擇培養(yǎng)3 h后進行誘導(dǎo)表達(dá)較優(yōu)。

圖2 不同誘導(dǎo)物對蛋白表達(dá)的影響

表2 不同誘導(dǎo)時機下菌體的OD600

圖3 不同誘導(dǎo)時機對蛋白表達(dá)的影響

2.4 誘導(dǎo)時間的優(yōu)化 外源蛋白在宿主菌中的積累會隨著時間而發(fā)生變化。一般會隨著時間的進行，從零開始逐漸增多，直至達(dá)到一峰值，有些工程菌會維持峰值不變，有些會隨著時間的進行，由于菌體內(nèi)蛋白酶的作用，外源蛋白的表達(dá)量會轉(zhuǎn)而降低。因此篩選出合適的誘導(dǎo)時間對獲得高產(chǎn)、控制發(fā)酵進程有重要意義。 本試驗中，抗CAP單鏈抗體基因工程菌誘導(dǎo)3 h的蛋白表達(dá)量為 35%，誘導(dǎo)4 h為 45%，誘導(dǎo)5 h為 40%，如圖4。因此把誘導(dǎo)時間定為4 h是一個較好的選擇。

圖4 不同誘導(dǎo)時間對蛋白表達(dá)的影響

3 討論與小結(jié)

基因工程產(chǎn)品的表達(dá)優(yōu)化對于工業(yè)生產(chǎn)有著重要的意義。通過表達(dá)優(yōu)化，可以為發(fā)酵生產(chǎn)提供良好的工藝條件，降低成本，提高經(jīng)濟效益，提高產(chǎn)品的競爭力（顧娟等，2010）。外源蛋白表達(dá)的影響因素較多，有培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、誘導(dǎo)物的種類、誘導(dǎo)物的濃度、誘導(dǎo)時機、誘導(dǎo)時間等，其中誘導(dǎo)物的種類、誘導(dǎo)時機、誘導(dǎo)時間是較為重要的三個影響因素（邊六交等，2006）。本實驗就此三個主要因素，對抗氯霉素單鏈抗體的高效表達(dá)進行了研究。實驗中發(fā)現(xiàn)，三個因素均對表達(dá)有較大影響，最終選取IPTG作為誘導(dǎo)物、接種后培養(yǎng)3 h進入對數(shù)生長中期開始誘導(dǎo)、誘導(dǎo)4 h結(jié)束作為高效表達(dá)的優(yōu)化工藝。

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[2]顧娟，勞勛，金明飛，等.人胰高血糖素樣肽-1突變體融合蛋白在大腸桿菌中的自誘導(dǎo)表達(dá)優(yōu)化[J].微生物學(xué)通報，2010，37（5）：726 ～ 731.

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[5]袁耀輝，李鋒，柴春彥，等.動物性食品中氯霉素殘留檢測技術(shù)進展[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2008，6：5 ～ 7.