綜合糾正胰島素抵抗對SHR大鼠心肌的保護作用

靳 淇 陳海燕 王 威 孔 儉

(吉林大學第一醫(yī)院干部病房，吉林 長春 130021)

目前，世界范圍內降壓治療的趨勢是在降壓同時改善代謝紊亂，預防靶器官損害或逆轉靶器官的重塑。自從胰島素抵抗與高血壓之間的關系被揭示，通過應用胰島素增敏劑改善胰島素抵抗的降壓治療，以達到降低高血壓的發(fā)病率和病死率的策略和治療方向正逐漸被人接受。本文利用吡格列酮配合生活方式干預作為糾正胰島素抵抗的綜合措施，重點觀察采取綜合措施糾正胰島素抵抗對自發(fā)性高血壓(SHR)大鼠心肌的保護作用，探討改善胰島素抵抗與高血壓之間的關系。

1 材料與方法

1.1 動物 SHR大鼠33只，雄性，購自北京維通利華公司，鼠齡6～7 w，體重120～160 g，分為4～6只/籠飼養(yǎng)，室溫20℃ ～24℃，控制晝夜光照，避免過多噪聲及其他干擾。觀察期為1 w，實驗期為12 w。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥方法 全部大鼠隨機分為3組，觀察飼養(yǎng)1 w使大鼠適應環(huán)境。①SHR空白組(SHR組，n=11)，予鼠糧及清水。②吡格列酮配合生活方式干預組(P組，n=11)，予鹽酸吡格列酮45 mg/L，加入飲水中灌胃。批號:H20050200，廠家:日本武田藥品工業(yè)株式會社，同時給予生活方式干預。③硝苯地平組(N組，n=11)，硝苯地平加入飲水中，140 mg/L灌胃。

1.2.2 生活方式干預方法 ①飲食控制方法:每周測量1次SHR組大鼠24 h進食量，計算平均進食量，P組每日清晨給予SHR組平均鼠糧的90%;②游泳方法及條件:P組每日觀察游泳6～15 min，同一時間在安靜條件下進行，以大鼠漂浮水面不動并出現頭部下沉為停止信號，水溫28℃ ～30℃，水深50 cm，保證大鼠不能觸及底部及側壁逃避運動。SHR組及N組大鼠僅放置于鼠籠中自由生活及進食。

1.2.3 血液采集方法 在實驗第12周結束時，大鼠禁食8 h后，乙醚麻醉，仰位固定于手術臺上，腹主動脈取血，血液標本10 min內以4 000 r/min速度離心5 min后2 h內送檢，比色法測量血清中eNOS水平(eNOS試劑盒購于南京建成生物工程研究所)。

1.2.4 組織取材 將麻醉大鼠沿正中線剪開腹腔，開胸迅速取出心臟，用生理鹽水沖洗殘血后濾紙吸干。取左室游離壁心肌約0.3 cm×0.3 cm，置于10%中性甲醛溶液中固定。

1.2.5 光鏡標本制作 大鼠左室游離壁心肌經乙醇充分脫水后，二甲苯透明，石蠟包埋，制成5μm厚的切片保存，蘇木素-伊紅(HE)染色，在200倍光鏡(Olympus PM-10AO)下觀察心肌病變的組織學形態(tài)。

1.2.6 免疫組化方法檢測大鼠心肌eNOS蛋白表達 采用抗生物素-生物素-過氧化物酶復合物法(ABC)，按說明書操作，二氨基聯苯胺(DAB)顯色，兔抗大鼠eNOS抗體購于武漢博士德生物工程公司，以細胞質內呈現棕黃色顆粒，且其著色強度高于背景非特異性染色者判定為陽性。應用 LX70OLYMPUS顯微鏡Cooled CCD采集視野圖片，采用計量分析系統(Image-Pro-Plus Analysis Software)進行分析，計算各組大鼠心肌陽性信號的平均密度。

1.3 統計學分析 應用SPSS13.0統計軟件進行分析，數據資料以x±s表示，組間比較采用方差分析。

2 結果

2.1 一般情況 實驗前期，各組大鼠飲食及活動正常。實驗開始后，SHR組及N組大鼠不限制鼠糧及飲水，P組每日清晨給予SHR組前1 w每日平均進食量的90%。P組大鼠第1周游泳時間為6～8 min，第12周時可堅持到15 min，呈現逐漸延長趨勢。整個實驗期大鼠無意外死亡。

2.2 大鼠血清eNOS水平 P組大鼠血清中eNOS含量〔(20.2±3.9)U/ml〕最高，與 SHR 組〔(16.7 ±4.2)U/ml〕相比差異有顯著性意義(P＜0.05)，SHR組與N組大鼠血清中eNOS含量〔(16.0±2.6)U/ml〕相比差異無顯著性意義。

2.3 大鼠心肌光鏡觀察結果 SHR組:心肌間質擴大、水腫，心肌內層可見點狀或微小心肌壞死，局部伴少量單核細胞及淋巴細胞浸潤，心內膜和心外膜未見異常。N組:心肌間質輕度增大、水腫，心肌內層、心壁內可見點狀心肌壞死，局部伴少量單核細胞及淋巴細胞浸潤，心內膜和心外膜未見異常。P組:心肌間質增大、水腫較SHR組減輕，心肌內層可見點狀或微小心肌壞死，壞死灶較SHR組及N組減輕，局部無明顯單核細胞及淋巴細胞浸潤，心內膜和心外膜未見異常。見圖1。

2.4 免疫組化結果 各組大鼠心肌細胞質中均可見eNOS陽性信號表達，其中SHR組著色強度較淺，呈淡黃褐色，P組著色強度最深，呈棕黃色。通過灰度掃描計算，N組著色強度〔(16.5±2.8)%〕略高于SHR組〔(14.3±2.4)%〕，與SHR組相比，差異沒有統計學意義(P＞0.05);P組〔(38.4±4.2)%〕大鼠心肌eNOS表達高于SHR組及N組，差異具有統計學意義(P＜0.01)。見圖2。

圖1 心肌光鏡觀察結果(HE，×200)

圖2 心肌eNOS免疫組化結果(DAB，×200)

3 討論

近年來認為高血壓是代謝綜合征(MS)的重要組成部分，與胰島素抵抗有直接關系。許多研究表明高血壓人群約60%伴有胰島素抵抗，同時提示高胰島素血癥是導致高血壓的重要原因〔1，2〕。筆者先前的研究工作發(fā)現吡格列酮配合生活方式干預有很好的降低SHR大鼠血壓的作用，可能是通過減輕胰島素抵抗、增加胰島素敏感性來發(fā)揮降壓機制，同時這種治療組合方法可較好的調整糖脂代謝，血管壁保護作用強，可減輕動脈硬化發(fā)生的危險因素〔3～5〕。胰島素增敏劑配合生活方式干預的綜合治療措施可作為糾正胰島素抵抗的方法應用到存在胰島素抵抗的原發(fā)性高血壓的治療當中。

血管內皮細胞是人體最大的內分泌、旁分泌器官，能分泌幾十種血管活性物質，NO就是其中之一。血管內皮也是高血壓形成和發(fā)展過程中重要的靶組織，與高血壓有密切的關系。高血壓可以導致并加重血管內皮功能障礙，而血管內皮細胞功能受損反過來又能加劇血壓的增高〔6，7〕。NO信號系統的健全又是內皮細胞發(fā)揮生理作用的關鍵，血管內皮細胞分泌的NO是由eNOS經多步氧化還原反應生成的，NO是調節(jié)血管基礎張力和血壓的重要因子，是迄今所知最強的內源性血管舒張因子。體內eNOS受遺傳和環(huán)境因素的調節(jié)，其活性需多種因素的參與和調控，在多種心血管疾病中發(fā)現eNOS基因表達發(fā)生改變〔8〕，已有學者將eNOS作為心血管疾病基因治療的首選酶〔9〕。研究證明eNOS活性降低，NO生成減少是血壓升高的重要原因〔10～12〕。本研究顯示，P組大鼠血清中eNOS含量最高，提示吡格列酮配合生活方式干預可以通過升高血液中eNOS含量，恢復eNOS生物學功能并減輕氧化應激，發(fā)揮降壓及心血管系統保護作用。

光鏡下心肌形態(tài)學觀察顯示各組大鼠心肌HE染色心內膜和心外膜未見明顯異常，心肌間質均有不同程度的增大、水腫，心肌內層可見小灶狀心肌壞死，單核細胞及淋巴細胞浸潤程度也不同。心肌形態(tài)學病理改變以SHR組及N組程度最重，P組病理改變最輕，而且無明顯單核細胞及淋巴細胞浸潤，可見高血壓可導致左室向心性肥厚。SHR大鼠心肌間質水腫，輕度壞死并出現代償性損傷的改變，是左室心功能受損的形態(tài)學基礎。吡格列酮配合生活方式干預可明顯抑制高血壓引起的心肌間質增大及水腫，減輕心肌內層的微小心肌壞死及單核細胞、淋巴細胞浸潤，發(fā)揮了良好的心臟保護作用，并且效果明顯好于硝苯地平。

硝苯地平是一種短效鈣離子拮抗劑，為二氫吡啶類化合物，在本實驗中置于大鼠飲水中供24 h飲用。結果發(fā)現硝苯地平對心肌也有一定的保護作用，支持國外的研究結果〔13〕。鈣拮抗劑對高血壓心血管系統的保護作用主要是通過減輕細胞內的Ca2+超載，抑制心肌纖維的過度收縮，減少能量消耗和溶酶體酶系的活性。近年來的研究發(fā)現硝苯地平也還具有增加NO活性、減輕自由基損傷、保護血管內皮功能等方面的作用，從而對心血管系統產生較好的保護作用〔14〕，有關研究結果鞏固了鈣拮抗劑類降壓藥物的核心地位。

心肌eNOS免疫組化結果顯示，各組大鼠心肌細胞質中可見eNOS陽性信號表達，強度有所不同，以SHR組及N組最弱，P組最強。通過灰度掃描計算，P組心肌eNOS表達均明顯高于SHR組及N組?？梢钥闯觯哐獕簳r，心肌eNOS可有一定程度的表達，提示在損傷因素存在時，機體有一定的保護能力，eNOS呈代償性增高，但增高的程度有限，不足以對抗損傷因素，導致靶器官持續(xù)受損。硝苯地平治療后可以提高心肌eNOS表達，但與SHR組相比無明顯差異。分析原因可能為硝苯地平是短效鈣拮抗劑，實驗發(fā)現其降壓迅速有效，開始時即能對SHR大鼠血壓增長有良好的控制，但缺乏持久性，實驗后期其治療組血壓有回升趨勢，eNOS保護作用下降，心肌呈低表達狀態(tài)。應用吡格列酮配合生活方式干預治療的SHR大鼠，心肌eNOS免疫組化呈強陽性表達，提示胰島素增敏劑配合生活方式干預具有很好的心肌保護作用。這種綜合干預措施顯著地對高血壓所致的心臟結構和功能均有較好的保護作用，避免或減輕SHR大鼠的靶器官受損。

降壓藥物的心血管系統保護作用至關重要，只有具備這種保護作用的降壓藥物才有臨床應用價值及進一步研究的前景，才有可能被廣泛應用來降低高血壓患者心血管并發(fā)癥的發(fā)病率。近些年來國內外開始關注噻唑烷二酮類藥物(TZDs)降壓作用和心血管系統保護作用的研究，國內外有關TZDs心血管系統保護作用機制的研究顯示〔15～17〕，TZDs作為人工合成的過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR-γ)的激動劑，可以明顯緩解胰島素抵抗和平抑高胰島素血癥，抑制平滑肌細胞的增殖和遷移，抑制巨噬細胞產生的炎癥因子，避免氧化損傷，抑制Ca2+通道活性，從而保護內皮細胞的形態(tài)與功能，減輕平滑肌細胞的增殖以及膠原組織在血管壁的堆集。這些研究結果均可揭示胰島素抵抗在高血壓心血管系統并發(fā)癥的形成和發(fā)展過程中的重要病理基礎，因此應用有糾正胰島素抵抗作用的藥物進行對高血壓靶器官保護作用的研究，對高血壓發(fā)病機制的完善也有著深遠的意義。本實驗從形態(tài)學上及免疫組織化學的角度發(fā)現應用吡格列酮配合生活方式干預的搭配方法在取得良好降壓效果的同時還具有心肌保護作用，這種抑制靶器官受損的作用是今后對TZDs研究的重點。

1 Zemel MB.Insulin resistance vs.hyperinsulinemia in hypertension:insulin regulation of Ca2+transport and Ca2+regulation of insulin sensitivity〔J〕.JNutr，1995;125(6):1738-43.

2 Guo X，Cheng S，Taylor KD，et al.Hypertension genes are genetic markers for insulin sensitivity and resistance〔J〕.Hypertension，2005;45(4):799-803.

3 王 威，孔 儉，李 杰，等.吡格列酮配合生活方式干預對大鼠血壓的影響〔J〕.中國老年學雜志，2010;30(14):1988-90.

4 王 威，孔 儉，陳海燕，等.吡格列酮配合生活方式干預對SHR大鼠血壓及糖脂代謝的影響〔J〕.中國老年學雜志，2010;30(18):2629-30.

5 陳海燕，李 杰，王 威.吡格列酮配合生活方式干預對SHR大鼠主動脈壁的保護作用〔J〕.中國老年學雜志，2010;30(13):1854-6.

6 Chamiot-Clert P，Renaud JF，Safar ME.Pulse pressure，aortic reactivity，and endothelium dysfunction in old hypertensive rats〔J〕.Hypertension，2001;37(2):313-21.

7 Mayet J，Hughes A.Cardiac and vascular pathophysiology in hypertension〔J〕.Heart，2003;89(9):1104-9.

8 Chatterjee A，Black SM，Catravas JD.Endothelial nitric oxide(NO)and its pathophysiologic regulation〔J〕.Vascul Pharmacol，2008;49(4-6):134-40.

9 Yetik-Anacak G，Catravas JD.Nitric oxide and the endothelium:history and impact on cardiovascular disease〔J〕.Vascul Pharmacol，2006;5(45):268-76.

10 汪培華，趙春霞，林 立，等.內皮型一氧化氮合酶基因對果糖誘導高血壓大鼠的降壓效應〔J〕.中華心血管病雜志，2003;31(4):289-92.

11 宋鐵山，李旭光，唐茂林.導入人內皮型一氧化氮合酶基因對高鹽飲食大鼠的血壓及腎臟功能的影響〔J〕.中華高血壓雜志，2007;15(4):303-6.

12 Cohen JD.Overview of physiology，vascular biology，and mechanisms of hypertension〔J〕.JManag Care Pharm，2007;13(5):6-8.

13 Hoffman JJ，Gilbert TB，Poston RS，et al.Myocardial reperfusion injury:etiology，mechanisms，and therapies〔J〕.J Extra Corpor Technol，2004;36(4):391-411.

14 Biswas Tk.Endothelium atherosclerosis and calcium channel blockers〔J〕.J Indian Med Assoc，2003;101(7):428-31.

15 Wakino S，Law RE，Hsuch WA，et al.Vascular protective effects by activation of nuclear receptor PPAR-gamma〔J〕.J Diabetes Complications，2002;16(1):46-9.

16 Law RE，Jaackson S，Hsueh WA，et al.Expression and function of PPAR-gamma in rat and human vascular smooth muscle cells〔J〕.Circulation，2000;101(11):1311-8.

17 Fujiwara T，Horikoshi H.Troglitazone and related compounds:therapeutic potential beyond diabetes〔J〕.Life Sci，2000;67(20):2405-16.