電針對擬老年性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶功能和海馬CA1區(qū)突觸可塑性的影響

王 威 唐 偉 孫忠人

(大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，遼寧 大連 116001)

迄今為止，治療老年性癡呆(AD)尚無特效藥物。長期以來針刺治療AD的實驗研究多局限于單因素的動物模型，不能充分體現(xiàn)AD與衰老及多種環(huán)境因素相關(guān)的病理機(jī)制。本研究通過建立一個集衰老、鋁中毒以及膽堿能系統(tǒng)損害等多因素的AD動物模型，采用行為學(xué)、免疫組化和圖像分析技術(shù)，研究針刺對AD大鼠學(xué)習(xí)記憶、海馬CA1區(qū)超微結(jié)構(gòu)和突觸素表達(dá)的影響，探討針刺改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的中樞機(jī)制，為針刺治療AD提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與設(shè)備 健康雄性Wistar大鼠50只，由大連醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供(許可證號為遼實動質(zhì)字〔2000〕028號)。自由進(jìn)食，每日照明12 h，室溫(23±2)℃。JEM-1220型透射電子顯微鏡;LKB-V超薄切片機(jī);跳臺儀(大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院提供);圖像分析系統(tǒng)(Image Pro Plus 6.0，美國)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理 按照體重將50只大鼠隨機(jī)分成4組:空白對照組(10只)、空白電針組(10只)、模型組(15只)和模型電針組(15只)。全部實驗動物用相同的飼料喂養(yǎng)，整個喂養(yǎng)過程中所使用的器皿均為非鋁制品。①空白對照組:予常規(guī)飲水和飼料，并胃飼及腹腔注射與模型組等容量的生理鹽水;②空白電針組:在給予生理鹽水同時進(jìn)行電針治療;③模型組:東莨菪堿(SCOP)+AlCl3+D-半乳糖(D-gal);④模型電針組:在造模同時進(jìn)行電針治療。

1.2.2 穴位選擇 ①百會:頂骨正中;②大椎:第七頸椎棘突與第一胸椎間，背部正中;③腎俞:第二腰椎下兩旁;④足三里(后三里):膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約5 mm處。

1.2.3 針刺方法 用0.25 mm×15 mm毫針針刺大鼠“百會”穴，向前斜刺約3 mm，“大椎”穴，直刺約4 mm，雙側(cè)“腎俞”穴，直刺進(jìn)針5 mm，雙側(cè)“足三里”穴，直刺進(jìn)針5 mm。連接KWD-808Ⅱ型全能脈沖電療儀，疏波，頻率為2 Hz，電壓為2 V，強(qiáng)度以肢體輕微抖動為度;1次/d，時間20 min。10 d為1個療程，間歇1 d，治療3個療程后進(jìn)行行為學(xué)測試。

1.2.4 大鼠行為學(xué)檢測 跳臺實驗〔1〕:電針治療結(jié)束后進(jìn)行跳臺實驗;實驗裝置體積為15 cm×30 cm×30 cm的被動條件反射箱，箱底鋪以銅柵，銅絲直徑為2 mm，間距為5 mm;電流強(qiáng)度由一個可調(diào)變壓器控制，通以36 V電流，箱內(nèi)右后側(cè)放置一個高和直徑均為4.5 cm的橡皮墊作為大鼠逃避電擊的安全區(qū)。將大鼠放入箱中自由活動3 min，熟悉環(huán)境，然后箱底通以電流，其正常反應(yīng)是跳上平臺以躲避傷害性刺激;記錄大鼠首次跳到銅柵上的時間(即潛伏期)和5 min內(nèi)大鼠跳到銅柵上的次數(shù)(錯誤次數(shù))，以此作為學(xué)習(xí)成績。24 h后重復(fù)試驗，記錄其第一次跳下橡皮墊的潛伏期和5 min內(nèi)的錯誤次數(shù)，從而反映大鼠的記憶保持能力。

1.2.5 海馬區(qū)CA1區(qū)蘇木素-伊紅(HE)染色和突觸素表達(dá)檢測 用10%水合氯醛將大鼠麻醉，于冰臺上迅速取出腦組織，分離海馬，切片并置于10%中性甲醛溶液中固定，4℃過夜，常規(guī)梯度脫水，透明，石蠟包埋，切片(4μm)。用HE染色光鏡下觀察海馬CA1區(qū)組織形態(tài)學(xué)變化。用鏈霉菌抗生物素蛋白過氧化物酶(SP)免疫組化方法染色，石蠟切片置于二甲苯脫蠟水化，加入3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。滴加一抗(兔抗大鼠突觸素濃度1∶150)，4℃孵育不少于18 h，加入生物素二抗，在37℃孵育20 min，DAB顯色，HE輕度復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片。在顯微鏡(Olympus，BX60，Japan)下觀察突觸素蛋白的表達(dá)，用圖像分析系統(tǒng)(Image Pro Plus 6.0，美國)測量其平均灰度值。

1.2.6 電鏡觀察海馬CA1區(qū)超微結(jié)構(gòu) 各組分別取5只大鼠，麻醉，暴露心臟，灌注4%多聚甲醛與1%戊二醛，取腦，分離并留取海馬CA1區(qū)，1%鋨酸4℃冰箱中固定1～2 h，逐級丙酮脫水，浸透2 h，Epon812包埋液，LKB型超薄切片機(jī)超薄切片(500?～800?)，醋酸鈾染，枸櫞酸鉛染。電鏡下觀察海馬CA1區(qū)超微結(jié)構(gòu)。每只大鼠觀察1張銅網(wǎng)，每張銅網(wǎng)連續(xù)拍攝10張照片，底片放大2.5萬倍印相。借助圖像分析系統(tǒng)和攝錄儀測量突觸的面數(shù)密度、面積密度和體積密度。面數(shù)密度即參照系截面單位面積內(nèi)顆粒截面數(shù)目，單位為個/μm2。面積密度表示膜面積相對于參照系體積的多少，單位為μm2/μm3。體積密度表示結(jié)構(gòu)體積在參照系體積中相對大小的參數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，各組間各參數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物數(shù)量 納入動物50只，48只大鼠進(jìn)入結(jié)果分析，模型組和模型電針組各有1只動物因胃飼誤入氣管致死。

2.2 跳臺實驗(潛伏期、錯誤次數(shù))結(jié)果 與空白對照組比較，模型組大鼠出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶功能障礙，潛伏期縮短，錯誤次數(shù)增加(P＜0.01)。與模型組比較，電針治療能夠改善大鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能，延長潛伏期和減少錯誤次數(shù)(P＜0.05，P＜0.01)。見表1。

表1 各組跳臺實驗結(jié)果(x±s)

2.3 海馬CA1區(qū)HE染色結(jié)果 空白對照組和空白電針組海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列整齊緊密，形態(tài)完整，胞漿豐富，胞核飽滿，核仁清晰。模型組神經(jīng)細(xì)胞缺失較多，殘留的神經(jīng)細(xì)胞排列松散不規(guī)則，邊界模糊，邊緣出現(xiàn)空泡，有的胞核消失。模型電針組神經(jīng)元數(shù)目較模型組明顯增多，神經(jīng)元胞漿豐富，核仁清晰。見圖1。

2.4 海馬CA1區(qū)突觸素表達(dá)結(jié)果 空白組、空白電針組海馬CA1區(qū)突觸素表達(dá)較多，二者之間無顯著性差異(P＞0.05)。模型組海馬CA1區(qū)突觸素表達(dá)減少，與空白組相比有顯著性差異(P＜0.01)。模型電針組與模型組比較，突觸素表達(dá)增加(P ＜0.01)。見表2，圖2。

圖1 海馬CA1區(qū)HE染色

圖2 海馬CA1區(qū)突觸素表達(dá)

2.5 海馬CA1區(qū)突觸電鏡結(jié)果 空白組、空白電針組神經(jīng)氈內(nèi)可見大量突觸，突觸前后成分境界清楚，輪廓完整，突觸前終末內(nèi)突觸小泡多，分布密集均勻，多為圓形清亮小泡。模型組神經(jīng)氈內(nèi)突觸數(shù)目減少，突觸前膜不清晰，突觸間隙模糊，前、后膜不明顯，突觸小泡明顯減少甚或消失，突觸前、后膜破壞變薄，典型的突觸結(jié)構(gòu)已不存在。模型電針組神經(jīng)氈內(nèi)可見較多突觸，突觸前終末內(nèi)突觸小泡也較多，可見較多圓形清亮小泡，密集分布，突觸前、后膜較模型組增厚，與空白組接近。見圖3。

圖3 海馬CA1區(qū)突觸超微結(jié)構(gòu)

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)突觸素表達(dá)和超微結(jié)構(gòu)各參數(shù)比較(x ± s，n=5)

3 討論

中醫(yī)防治AD主要是從整體的角度去分析這一病證的內(nèi)在實質(zhì)，針對某一病證個體做出客觀的判斷，實施針對性很強(qiáng)的防治措施。本研究所選百會穴為髓海的上俞穴，治療髓海不足健忘、老年性癡呆的要穴;大椎穴是手足六陽經(jīng)的交會穴，為“諸陽之會”;百會穴和大椎穴均為督脈之穴，二穴相配可通調(diào)諸經(jīng)，激發(fā)經(jīng)氣，增強(qiáng)各臟腑經(jīng)絡(luò)之功效，使腦髓得氣血榮養(yǎng)，促使陰陽平衡。腎俞為膀胱經(jīng)穴位，可益腎填髓充腦，《靈樞·經(jīng)脈》言“膀胱足太陽之脈，起于目內(nèi)眥，上額交巔。其直者，從巔入絡(luò)腦”。足三里為強(qiáng)壯保健的要穴，有延緩衰老的作用。如此配穴體現(xiàn)了配穴原則中的局部與遠(yuǎn)道取穴的結(jié)合運用。數(shù)穴合用，臨床上取得較好療效。

有研究表明，D-gal致亞急性衰老模型、慢性鋁中毒和SCOP中毒都能模擬老年癡呆樣改變〔2～4〕，三種因素復(fù)合的模型能更貼近AD復(fù)雜的病因和病理變化過程，在這種模型上研究針刺作用效果所得出的結(jié)論可能更加可靠。從本研究建立的集衰老、鋁中毒與東莨菪堿損害的多因素AD大鼠模型行為學(xué)觀察表明，大鼠跳臺測試的觸電潛伏期及5 min錯誤次數(shù)與對照組比較均有明顯改變。模型組海馬區(qū)形態(tài)學(xué)可見神經(jīng)細(xì)胞缺失，神經(jīng)氈內(nèi)突觸數(shù)目減少，突觸小泡明顯減少甚或消失，典型的突觸結(jié)構(gòu)已不存在，與臨床上AD的病理變化相似。

突觸變化是學(xué)習(xí)記憶形成的一個重要形態(tài)學(xué)和功能學(xué)基礎(chǔ)。突觸喪失會中斷很多功能通路的聯(lián)系，引起多方面的功能障礙，尤其是認(rèn)知和記憶功能障礙。Selkoe〔5〕通過顳、額葉皮質(zhì)活檢研究發(fā)現(xiàn)，早期AD患者皮質(zhì)的突觸密度減和神經(jīng)元的突觸數(shù)目減少均減少。突觸素是一種與突觸結(jié)構(gòu)和功能極為相關(guān)的膜蛋白，參與突觸小泡膜與突觸前膜的融合和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，是突觸重建的重要標(biāo)志〔6〕。研究發(fā)現(xiàn)突觸素免疫活性與AD患者的認(rèn)知障礙程度相關(guān)〔7〕，國內(nèi)學(xué)者洪岸〔8〕用單克隆抗突觸素抗體免疫組化染色，結(jié)果表明老年損害組大鼠海馬、齒狀回突觸素免疫反應(yīng)產(chǎn)物灰度較青年組、老年正常組明顯降低;老年大鼠平均逃避潛伏期與其海馬結(jié)構(gòu)突觸素免疫反應(yīng)產(chǎn)物灰度呈顯著負(fù)相關(guān)，提示老年學(xué)習(xí)記憶能力與海馬結(jié)構(gòu)突觸素有密切聯(lián)系。而本實驗?zāi)Ｐ徒M潛伏期縮短，錯誤次數(shù)增多，海馬CA1區(qū)突觸素表達(dá)減少。突觸素是在神經(jīng)元胞體合成，在囊泡中被運至軸突終末。突觸素表達(dá)減少的可能原因:①軸突終末丟失;②突觸素合成減少。

有研究表明針刺具有拮抗衰老過程中的病理生理變化〔9～11〕。本實驗針刺治療組海馬CA1區(qū)突觸素表達(dá)明顯多于模型組，提示針刺促進(jìn)了海馬區(qū)突觸素表達(dá)。而電鏡下觀察到電針組海馬區(qū)神經(jīng)氈內(nèi)可見較多突觸，突觸前終末內(nèi)突觸小泡也較多，可見較多圓形清亮小泡密集分布，與突觸素免疫反應(yīng)結(jié)果相吻合。針刺改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的機(jī)制，可能是針刺刺激增加了大鼠由于造模而損傷壞死的邊緣區(qū)的記憶突觸，即膽堿能突觸，使其密度增加，從而使殘存的神經(jīng)元發(fā)揮更大的作用，使記憶突觸間隙變窄，得以加速突觸間的傳導(dǎo)功能;同時腦內(nèi)存在一些神經(jīng)傳導(dǎo)的旁路，針刺刺激可引起神經(jīng)沖動，經(jīng)外周神經(jīng)傳導(dǎo)至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，經(jīng)平時少起作用的旁路刺激大腦皮層，從而引起壞死邊緣區(qū)突觸數(shù)目和結(jié)構(gòu)的改變;突觸后膜致密物質(zhì)厚度增加，可能與某些酶及其底物蛋白的磷酸化過程引起其分子構(gòu)型改變有關(guān)，這可能是功能變化的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。因此，可以推測針刺是通過促進(jìn)海馬內(nèi)突觸重建，提高突觸素的表達(dá)，從而改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，這可能是針刺改善AD大鼠模型智能障礙的機(jī)制之一，也為針刺治療AD提供了思路。

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