Aβ寡聚體預處理的BV2細胞對PC12細胞損傷的影響及其機制

藺慕會 何金婷 陳曉虹 徐忠信

(遼寧省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽 110016)

IL-1β是IL-1家族中主要的活性分子〔1〕，在腦內(nèi)主要來源于小膠質(zhì)細胞〔2〕。在阿爾茨海默病(AD)患者腦中，IL-1β濃度增高與小膠質(zhì)細胞活化間有明顯相關性〔3〕，提示IL-1β、小膠質(zhì)細胞活化有可能參與了AD的發(fā)生、發(fā)展過程。本研究選擇與神經(jīng)元生物學特性有很多相似之處的PC12細胞及已被廣泛用來體外培養(yǎng)并代替小膠質(zhì)細胞的BV2細胞共同培養(yǎng)，進而探討由Aβ寡聚體預處理的BV2細胞對PC12細胞凋亡的影響及IL-1β在此過程中的作用，來研究小膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元損傷的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料 PC12細胞購于中國科學院北京細胞生物研究所，BV2細胞購于上海復祥生物科技有限公司。細胞轉移篩網(wǎng)購于美國BD Falcon公司;RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購于 Gibco公司;Aβ1-42，六氟丙醇(HFIP)，抗 tau，tau(pS396)一抗、二抗購于Sigma公司;MTT(噻唑藍)購于上海華舜生物工程有限公司;BCA蛋白定量試劑盒購于美國PIERCE公司。Western印跡化學發(fā)光檢測試劑盒和小鼠IL-1βELISA試劑盒購于武漢博士德公司;IL-1ra購于R＆D系統(tǒng)(Minneapolis MN);IL-1β購于Sigma公司。

1.2 實驗分組 對照組(Aβ+PC12組):PC12細胞培養(yǎng)液中加入Aβ1-42(0、10μmol/L)孵育24 h。實驗組1(Aβ+BV2+PC12組):BV2 細胞經(jīng) Aβ1-42(0、1、5、10 μmol/L)預處理 24 h后檢測IL-1β，并選擇0、10μmol/L組與PC12細胞共育24 h。實驗組 2(IL-1β +PC12 組):IL-1β(0、0.3、1、3、10 ng/ml)加入PC12細胞培養(yǎng)液中孵育24 h;實驗組3〔(Aβ+BV2)+(PC12+IL-1ra)組〕:選擇 0、10 μmol/L組，預先用 IL-1ra(50 ng/ml)孵育PC12細胞1 h后，進行實驗組1的細胞培養(yǎng)。

1.3 Aβ寡聚體的制備及細胞培養(yǎng) 按Klein WL(2002)方法制備Aβ1-42寡聚體〔4〕，用RPMI1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 g/L鏈霉素)將PC12細胞培養(yǎng)在24孔培養(yǎng)板中。用DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)將BV2細胞培養(yǎng)在轉移篩網(wǎng)上。在BV2細胞經(jīng)Aβ1-42處理24 h后，將培養(yǎng)液及生長有BV2細胞的轉移篩網(wǎng)同時移入PC12細胞培養(yǎng)板與PC12細胞共育。

1.4 BV2細胞培養(yǎng)液中IL-1β含量的檢測 不同濃度Aβ1-42(0、1、5、10 μmol/L)處理 BV2 細胞 24 h 后，收集培養(yǎng)液，按照試劑盒說明書，用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測培養(yǎng)液中IL-1β的含量。以96孔酶標計數(shù)儀檢測光密度值。根據(jù)對數(shù)公式，通過樣品OD值計算出IL-1β量。

1.5 Western印跡法檢測PC12細胞tau(pS396)、tau蛋白表達將蛋白裂解緩沖液(預冷至0℃)加入經(jīng)過漂洗的單層PC12細胞中，靜置20 min;用細胞刮棒收集細胞，用蛋白定量分析(BCA法)測定總蛋白濃度。加樣蛋白含量50μg，經(jīng)10%SDSPAGE電泳分離，4℃條件下轉膜，置膜于5%脫脂奶粉封閉1 h，在室溫下分別加入兔抗大鼠tau(pS396);tau一抗(1∶1 000)，4℃ 過夜，室溫下加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶4 000)，60 min;化學發(fā)光顯色，計算機掃描分析。

1.6 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS10.0軟件進行t檢驗。

2 結果

2.1 Aβ預處理的BV2細胞培養(yǎng)液中IL-1β含量 Aβ寡聚體預處理的BV2細胞培養(yǎng)液中可檢測出IL-1β，隨著Aβ寡聚體濃度(0，1，5，10 μmol/L)的增加，IL-1β 含量也明顯增加〔(16.50 ±1.60)，(1 102.13 ±138.25)，(2 522 ±94.77)，(2 965 ±121.3)pg/ml〕(P ＜0.05)。

2.2 不同濃度IL-1β處理后PC12細胞tau(pS396)、tau蛋白表達情況 IL-1β(0.3、1、3、10 ng/ml)加入PC12細胞培養(yǎng)液中孵育24 h后，可見PC12細胞tau(pS396)/總tau蛋白比值〔分別為(21.240±2.26)%、(27.775±1.103)%、(35.691±1.320)%、(38.836±1.530)%〕較未加入IL-1β組〔(11.201±2.171)%〕增多(P＜0.05)，并呈現(xiàn)一定的量效關系。見圖1。

圖1 不同濃度IL-1β處理后PC12細胞tau(p S396)、tau蛋白表達結果

2.3 IL-1ra對PC12細胞tau(pS396)蛋白表達的影響 IL-1β(3 ng/ml)+ PC12 組 (35.691% ± 1.320%)，Aβ(10μmol/L)+BV2+PC12組，Aβ(10 μmol/L)+BV2+PC12+IL-1ra組tau表達(12.660% ±2.002%)無明顯變化;tau(pS396)/總tau比值 Aβ(10μmol/L)+PC12組(35.694% ±1.523%)，Aβ(10μmol/L)+BV2+PC12 組(49.504% ±3.146%)均明顯增加(P＜0.05)，后者與前者相比tau(pS396)表達進一步增多(P＜0.05);Aβ(10μmol/L)+BV2+IL-1ra+PC12組(40.611% ±3.019%)與 Aβ(10μmol/L)+BV2+PC12組相比tau(pS396)表達有所減少(P＜0.05)。見圖2。

圖2 各組PC12細胞tau(pS396)、tau蛋白Western印跡表達結果

3 討論

IL-1β是IL-1家族的主要活性分子〔1〕，在成年后腦內(nèi)表達水平很低。但在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥、損傷等疾病后，IL-1含量顯著增加〔5〕。研究發(fā)現(xiàn)，AD患者腦中IL-1β表達水平升高，其血清中的IL-1β也比正常老年人高出數(shù)倍，并且IL-1β多態(tài)性與AD的發(fā)病和進展密切相關〔6〕。

表達P2X7受體的小膠質(zhì)細胞(MG)在Aβ作用下可分泌大量的IL-1β〔2〕，Griffin等1989年首次發(fā)現(xiàn)AD患者腦中 IL-1活性、MG數(shù)量較對照組增加約6倍，提示在AD患者腦中MG可能是IL-1的主要來源〔7〕。本研究首先用Aβ寡聚體公認的AD致病因子作用于BV2細胞，排除其他因素干擾，發(fā)現(xiàn)BV2細胞能分泌較多IL-1β至培養(yǎng)液上清。并且Aβ寡聚體與BV2分泌的IL-1β有劑量相關性，提示Aβ寡聚體與BV2細胞合成、分泌IL-1β有因果關系，支持既往觀點。

IL-1β在AD中的作用有學者認為起保護作用〔8〕，但多數(shù)認為IL-1β參與AD發(fā)展的炎癥反應中，處于反應鏈的前端，可進一步引起其他炎癥介質(zhì)如NO的增多，加重炎癥反應〔9〕，還可以直接引起神經(jīng)元tau蛋白磷酸化及突觸損傷〔10〕。本研究提示IL-1β可導致tau蛋白異常磷酸化，從而導致細胞骨架形成障礙，最終導致神經(jīng)元凋亡。

本研究結果提示 BV2細胞可促進 Aβ1-42寡聚體導致的PC12細胞tau(pS396)表達。為明確此作用是否與BV2細胞分泌IL-1β有關，本研究用IL-1ra預先處理PC12細胞，封閉PC12細胞IL-1β受體，IL-1受體拮抗蛋白(IL-1ra)在一級結構與空間構象上，與IL-1具有同源性，是IL-1的競爭性拮抗劑，對IL-1α及IL-1β受體結合能力都很強，足以阻斷二者的功能〔11〕。本結果提示BV2細胞加重Aβ1-42寡聚體對PC12細胞的損傷與其分泌IL-1β有關。當然，與對照組相比，IL-1ra并未完全拮抗BV2的損傷作用，因為Aβ1-42寡聚體處理BV2細胞后必然有其他因子產(chǎn)生，參與BV2細胞加重對PC12細胞的損傷過程，這一點也在3 ng/ml IL-1β+PC12組與10μmol/L+BV2+PC12組比較中發(fā)現(xiàn)，雖然BV2細胞經(jīng)Aβ(10μmol/L)處理24 h后產(chǎn)生IL-1β約為3 ng/ml左右，但3 ng/ml IL-1β+PC12組蛋白比值卻低于Aβ(10μmol/L)+BV2+PC12組，雖無統(tǒng)計學意義，但提示除了IL-1β外還有其他因素參與此過程。至于還有哪些因子參與還有待于進一步研究。

本研究通過體外細胞培養(yǎng)研究證實，IL-1β通過引起tau異常磷酸化通路參與BV2細胞加重Aβ寡聚體對PC12細胞損傷過程，提示對小膠質(zhì)細胞活化及對其分泌的炎性介質(zhì)進行干預，可能是治療AD的一條可行之路。但體內(nèi)環(huán)境復雜，是否通過阻斷AD病人IL-1β的作用，就能有助于阻止AD病情發(fā)展，還需進一步探討。

1 Rothwell NJ，Luheshi GN.Interleukin-1 in the brain:biology，pathology and therapeutic target〔J〕.Trends Neurosci，2000;23(12):618-25.

2 Sanz JM，Paola Chiozzi，Davide Ferrari，et al.Activation of microglia by amyloid β requires P2X7 receptor expression〔J〕.J Immunol，2009;182(7):4378-85.

3 Eriksson C，Van Dam AM，Lucassen PJ，et al.Immunohistochemical localization of interleukin-1beta，interleukin-1 receptor antagonist and interleukin-1 beta converting enzyme/caspase-1 in the rat brain after peripheral administration of kainic acid〔J〕.Neuroscience，1999;93(3):915-30.

4 Klein WL.Abeta toxicity in Alzheimer's disease:globular oligomers(ADDLs)as new vaccine and drug targets〔J〕.Neurochem Int，2002;41(5):345-52.

5 Shaftel SS，Kyrkanides S，Olschowka JA，et al.Sustained hippocampal IL-1 beta overexpression mediates chronic neuroinflammation and ameliorates Alzheimer plaque pathology〔J〕.J Clin Invest，2007;117(6):1595-604.

6 Déniz-Naranjo MC，Mu?noz-Fernandez C，Alemany-Rodríguez MJ，et al.Cytokine IL-1 beta but not IL-1 alpha promoter polymorphism is associated with Alzheimer disease in a population from the Canary Islands，Spain〔J〕.Euro JNeurol，2008;15(10):1080-4.

7 Lemere CA.A beneficial role for IL-1 beta in Alzheimer disease〔J〕?J Clin Invest，2007;117(6):1483-5.

8 Akama KT，Van Eldik LJ.β-Amyloid stimulation of inducible nitric-oxide synthase in astrocytes is interleukin-1β-and tumor necrosis factor-α(TNFα)-dependent，and involves a TNFα receptor-associated factor-and NFκB-inducing kinase-dependent signaling mechanism〔J〕.JBiol Chem，2000;275(11):7918-24.

9 Bellucci A，Westwood AJ，Ingram E，et al.Induction of inflammatory mediators and microglial activation in mice transgenic for mutant human P301Stau protein〔J〕.Am J Pathol，2004;165(5):1643-52.

10 Malyak M，Guthridge JM，Hance KR，et al.Characterization of a low molecular weight isoform of IL-1 receptor antagonis〔t J〕.JImmunol，1998;161(4):1997-2003.

11 Dinarello CA.Interleukin-1 and interleukin-1 antagonism〔J〕.Blood，1991;77(8):1627-52.