胰淀素對肥胖相關(guān)性腎病大鼠的致病作用

滕春燕 盧延軍 崔英春 劉樹軍 張冬梅

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院化驗(yàn)科，吉林 長春 130041)

現(xiàn)在認(rèn)為肥胖相關(guān)性腎病(Obesity-related glomerulopathy，ORG)的發(fā)生是體內(nèi)存在胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)的直接后果。已經(jīng)證明，由糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)患者體內(nèi)IR所致的高胰島素血癥和高胰淀素(Amylin)血癥，可以導(dǎo)致Amylin在腎小球和腎間質(zhì)的沉積，而成為腎小球結(jié)節(jié)樣病變以及間質(zhì)性損傷的病因之一。此外，Amylin還可以誘導(dǎo)系膜細(xì)胞凋亡，通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡加重局部組織損傷和纖維化的形成。ORG也伴有IR，也會(huì)出現(xiàn)高胰島素血癥和高Amylin血癥，但是否可以導(dǎo)致Amylin在腎小球的沉積、誘發(fā)腎臟損傷，目前尚未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬通過觀察ORG血液及腎臟病理學(xué)變化特征，探討Amylin在ORG中的致病作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 注射用大鼠 Amylin(Sigma公司);大鼠Amylin-ELISA檢測試劑盒(上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司);兔抗大鼠Amylin單克隆抗體、生物素化羊抗兔IgG及免疫組化試劑盒(Sigma公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)成年雄性Wistar大鼠40只，體重(200±20)g，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制作及分組 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，隨機(jī)分為三組:正常對照組(NC組，n=10)、ORG組(n=10)和Amylin皮下注射組(Amylin組，n=10)。根據(jù)文獻(xiàn)建立ORG大鼠模型〔1〕，ORG組和Amylin組大鼠給予高脂飼料(三大營養(yǎng)素所占比例:脂肪49%，蛋白質(zhì)21%，碳水化合物30%;具體組成:普通飼料59%，熟豬油20%，雞蛋黃10%，蔗糖9.5%和食鹽1.5%，熱卡21 kJ/g)，NC組給予普通飼料，自由攝食，自由飲水。ORG組和Amylin組大鼠在飼養(yǎng)8 w后用尿蛋白試紙檢測尿蛋白，出現(xiàn)尿蛋白即為ORG模型成功。ORG模型成功后，Amylin組大鼠給予大鼠Amylin皮下注射(100 μg/kg)〔2〕，隔日1次，持續(xù)8 w。NC組和ORG組大鼠給予同等劑量的生理鹽水皮下注射。

1.2.2 標(biāo)本采集 實(shí)驗(yàn)共經(jīng)歷24 w，大鼠處死前代謝籠留取24 h尿，檢測24 h尿蛋白定量(24 h-PRO)。乙醚麻醉下稱體重，測量體長即鼻至肛門的長度。心臟取血，3 000 r/min離心10 min，分離血清，－70℃保存。迅速開腹取出左腎，去掉被膜，經(jīng)腎門冠狀面取腎組織，置于新配制的10%中性緩沖甲醛液固定，用于光鏡觀察及免疫組化檢測。

1.2.3 各項(xiàng)指標(biāo)的檢測 (1)Lee's指數(shù)的計(jì)算:Lee's指數(shù)=〔體重(g)〕1/3×103/體長(cm)。(2)24 h-PRO檢測:考斯亮藍(lán)方法檢測。(3)血清學(xué)指標(biāo)檢測:采用ELISA法檢測血清Amylin水平;放射免疫法檢測胰島素水平;自動(dòng)生化分析儀測定血糖(SG)、血脂。(4)胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)計(jì)算公式:空腹血糖×空腹胰島素水平/22.5。(5)免疫組化親合素-生物素復(fù)合物(ABC)法:腎組織切片3μm，常規(guī)脫蠟至水，加入兔抗大鼠Amylin單克隆抗體(1∶100稀釋)，再加入生物素化的羊抗兔IgG(1∶100稀釋)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，封片觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以x±s表示，采用方差分析。兩組以上比較采用one way ANOVA檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般狀態(tài) 4 w內(nèi)NC組大鼠進(jìn)食和飲水情況、精神狀態(tài)以及活動(dòng)狀況均正常;ORG組和Amylin組大鼠進(jìn)食量減少，飲水明顯增加，行動(dòng)遲緩，活動(dòng)量減少。6 w后ORG組和Amylin組大鼠進(jìn)食量逐漸增加，飲水仍然較多，毛發(fā)色澤鮮亮，精神狀態(tài)良好，活動(dòng)增加;實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，ORG和Amylin組大鼠飲水和尿量均明顯增多，毛發(fā)光亮度減退，活動(dòng)減少，精神出現(xiàn)不同程度的萎靡。

2.2 各組大鼠Lee's指數(shù) 分組時(shí)(0 w)各組大鼠Lee's指數(shù)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，飼養(yǎng)至24 w實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，ORG組和Amylin組Lee's指數(shù)顯著高于NC組(P＜0.01)，ORG組和Amylin組兩組間無顯著差異(P＞0.05)。見表1。

表1 各組大鼠Lee's指數(shù)值(x±s)

2.3 各組大鼠 SG、血脂、HOMA-IR、Amylin水平及24 h-PRO的變化 與NC組比較，ORG組和Amylin組大鼠的SG、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、HOMA-IR和24 h-PRO均增高，其中ORG組的TC和24 h-PRO差異具有顯著性(P＜0.05)，Amylin組除血糖外，其余各指標(biāo)差異均具有顯著性(P＜0.01)，但兩組血糖雖升高，均在正常范圍內(nèi)且差異無顯著性。與ORG組比較，Amylin組除SG和HOMA-IR外，其余各指標(biāo)差異均具有顯著性(P＜0.01)。見表2。

2.4 各組大鼠腎小球形態(tài)學(xué)變化 見圖1。光鏡下，ORG組和Amylin組可見腎小球體積增大，Amylin組包曼氏囊腔增寬，兩組腎小球可見節(jié)段性系膜細(xì)胞增生和系膜基質(zhì)增多，部分腎小球球旁器肥大，較NC組變化明顯。

表2 各組大鼠SG、血脂、HOMA-IR、Amylin水平及24小時(shí)尿蛋白定量的變化(x±s)

圖1 各組大鼠腎小球形態(tài)學(xué)變化(PAS染色，×400)

2.5 各組大鼠腎小球免疫組化結(jié)果 NC組大鼠無Amylin表達(dá)，ORG組和Amylin組大鼠腎小球增寬的系膜區(qū)有表達(dá)，Amylin組表達(dá)量較多。見圖2。

圖2 Amylin在各組大鼠腎臟中的表達(dá)(ABC法，×400)

3 討論

肥胖在全世界呈流行趨勢，使其已經(jīng)與艾滋病、吸毒和酗酒并列為世界四大生活難題，被公認(rèn)為困擾人類健康的重要頑癥之一。已有研究證實(shí)肥胖可以引起腎損害，并命名為ORG。2002年6月我國首次報(bào)告ORG后〔3〕越來越多的研究者開始關(guān)注ORG，目前ORG尚無統(tǒng)一診斷標(biāo)準(zhǔn)〔4〕。研究表明IR、脂質(zhì)代謝紊亂(高脂血癥)、腎臟血流動(dòng)力學(xué)改變(腎臟高濾過、高灌注)、腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)活化及交感神經(jīng)系統(tǒng)(SNS)激活等是ORG的主要發(fā)病機(jī)制，其中IR在ORG的發(fā)病過程中起了重要的作用。IR狀態(tài)可影響多個(gè)臟器，包括骨骼肌、肝臟、脂肪細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞。胰島素能擴(kuò)張入球小動(dòng)脈引起腎小球高內(nèi)壓、高灌注及高濾過;通過刺激胰島素樣生長因子(IGF)合成，引起腎小球肥大;通過上調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)的表達(dá)促進(jìn)腎小球硬化。高胰島素亦可以直接作用于腎臟促進(jìn)鈉潴留。胰島素還能直接通過增加腎小管對尿酸的重吸收，導(dǎo)致高尿酸血癥，加重腎臟損傷〔5〕。

本研究發(fā)現(xiàn)，ORG組大鼠Lee's指數(shù)在第8周開始顯著增加，直至24 w實(shí)驗(yàn)結(jié)束，生化指標(biāo)中TC和24 h-PRO明顯增加，余生化指標(biāo)僅輕度增加，差異無顯著性，免疫組化觀察少許Amylin在增寬的系膜區(qū)表達(dá);而Amylin組大鼠除血糖外其余各項(xiàng)指標(biāo)均顯著增加，免疫組化可見大量Amylin在增寬的系膜區(qū)表達(dá)。由此推測，Amylin是病情發(fā)生過程中產(chǎn)生的一種蛋白因子，其本身可促進(jìn)病情加重，隨著病情加重進(jìn)一步產(chǎn)生Amylin，即Amylin與ORG互為因果，相互促進(jìn)。Amylin是一種纖維樣多肽，與胰島素共同儲(chǔ)存在胰島細(xì)胞的分泌顆粒中，當(dāng)Amylin表達(dá)、分泌異常時(shí)，可形成胰島淀粉樣蛋白，沉積在胰島細(xì)胞內(nèi)及其周圍，對胰島β細(xì)胞有細(xì)胞毒性作用，使胰島β細(xì)胞團(tuán)及胰島素分泌減少，導(dǎo)致β細(xì)胞功能障礙和部分胰島β細(xì)胞的喪失〔6，7〕，進(jìn)而參與IR及糖尿病相關(guān)組織器官損傷。本文預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Amylin組大鼠SG呈上升趨勢，已有2只大鼠SG接近糖尿病大鼠模型的血糖標(biāo)準(zhǔn)(16.7 mmol/L)，其可能是肥胖易發(fā)生糖尿病的致病因素之一。同時(shí)，免疫組化結(jié)果觀察到Amylin在模型大鼠腎臟增寬的系膜區(qū)沉積，與龔偉等研究結(jié)果一致〔8〕。

綜上所述，Amylin在ORG發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮重要作用，其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究，并可能成為DN和ORG新的治療靶點(diǎn)。

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