不同血清濃度及體外培養(yǎng)時間對小鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞系生長曲線和細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

董 萍 楊永鵬 丁克祥 劉 敏 羅迎霞 丁 宇 左夏林 韓晉云 楊方應(yīng) 丁振華

(大連市董萍醫(yī)療美容整形醫(yī)院美容整形外科，遼寧 大連 116011)

皮膚成纖維細(xì)胞是目前研究真皮層乃至整體皮膚老化改變較為重要和敏感的細(xì)胞系。Crowston等〔1〕發(fā)現(xiàn)，用人體血清培養(yǎng)的人肌腱成纖維細(xì)胞凋亡數(shù)量減少、增殖旺盛、生長狀態(tài)良好。然而，血清中除含有成纖維細(xì)胞生存和生長所需基本營養(yǎng)成分和細(xì)胞生長因子外，還含有某些細(xì)胞毒因子和抗體及酶類等。因此，成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)面臨著選取何種血清濃度和介質(zhì)及培養(yǎng)時間才能使其獲得更好的生存狀態(tài)、更高的生長活力等問題。本課題組曾報道〔2〕不同血清濃度和介質(zhì)對體外培養(yǎng)小鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞系生長曲線和細(xì)胞形態(tài)的影響，但在不同血清濃度、不同培養(yǎng)時間的條件下對體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞生存和生長影響的實驗研究卻報道較少。為此，本文選擇小鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞系，觀察細(xì)胞生長周期和細(xì)胞形態(tài)學(xué)以了解不同血清濃度及體外培養(yǎng)時間對成纖維細(xì)胞生存和生長狀況的影響，為探索成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)提供最佳微環(huán)境條件提供一定的參考和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細(xì)胞 小鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞系，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.1.2 主要試劑及配制 新生牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品;RPMI1640培養(yǎng)基，Hyclone公司產(chǎn)品;磷酸鹽緩沖劑(PBS)，北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品;乙二胺四乙酸(EDTA)、胰蛋白酶，上海生物工程有限公司產(chǎn)品;三氯乙酸(TCA)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;磺基羅丹明B(SRB)，購自Sigma-Aldrich公司;吖啶橙染液(AO)，購自Sigma公司;蘇木素-伊紅(HE)染液，購自中杉金橋試劑公司;醋酸，天津市化學(xué)試劑三廠產(chǎn)品;Tris堿，長沙鵬程生物公司產(chǎn)品;多聚甲醛，太陽生物公司產(chǎn)品;氨水，廣東光華化學(xué)有限公司產(chǎn)品;鹽酸，湖南省株洲市化學(xué)工業(yè)研究所產(chǎn)品;乙醇，天津市大茂化學(xué)試劑廠產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱，德國Heraeus公司產(chǎn)品;超凈工作臺，Heal force，上海申力科學(xué)儀器產(chǎn)品;BIO-RAD 550酶標(biāo)儀，BioRad公司產(chǎn)品;OLYMPUS倒置顯微鏡、OLYMPUS BX-60熒光顯微鏡，日本奧林巴斯公司產(chǎn)品;R200D電子天平，德國Storius公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞系培養(yǎng) 小鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞系用含10%新生牛血清的 RPMI1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng);待細(xì)胞達(dá)匯成片后，0.25%EDTA胰酶消化培養(yǎng)瓶細(xì)胞，血細(xì)胞板計數(shù)并制成細(xì)胞懸液;分別以2 500/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，以10 000/孔接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板。

1.2.2 分組 將貼壁后細(xì)胞按生長時間分組為:2、4、6、8 d組;按培養(yǎng)液中血清濃度分組為:0%組、20%組、40%組、60%組、80%組、100%組，各濃度設(shè)7個平行。按照配方配制各組培養(yǎng)液，見表1。

表1 不同濃度血清培養(yǎng)液具體配制方案

1.2.3 SRB法檢測細(xì)胞生長 96孔板細(xì)胞貼壁3～4 h后，棄掉10%新生牛血清培養(yǎng)液;按實驗分組每孔加入200μl含不同濃度血清的RPMI1640培養(yǎng)液;37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)2、4、6、8 d，并取細(xì)胞培養(yǎng)板檢測。棄掉培養(yǎng)液，PBS沖洗1～2次，每孔加入100μl 10%TCA，4℃固定1 h;棄掉TCA，去離子水沖洗3～5遍，干燥。每孔加入100μl 0.2%SRB染液，室溫下染色30 min;棄掉染液，用1%醋酸洗掉未結(jié)合的染液，干燥。每孔加入200μl pH10.5的10 mmol/L非緩沖Tris堿液，置搖床低速振蕩20 min。在酶標(biāo)儀A490波長下測量各孔的吸光值(OD值)，記錄分析。

1.2.4 HE染色 HE染細(xì)胞核著紫藍(lán)色，使細(xì)胞質(zhì)中的成分著淡紅色。①干預(yù):24孔板細(xì)胞貼壁3～4 h后，棄掉10%新生牛血清培養(yǎng)液;按實驗分組每孔加入400μl含不同濃度血清的RPMI1640培養(yǎng)液;37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)2、4、6、8 d，并取細(xì)胞培養(yǎng)板檢測。②固定:棄掉培養(yǎng)液，PBS沖洗，每孔加入200μl 4%多聚甲醛，室溫固定20 min，棄掉固定液，PBS沖洗。③染色:HE染色5 min，吸掉染液，流水洗掉未結(jié)合的HE染液。④分化:1%鹽酸乙醇瞬間分化，流水稍微沖洗。⑤返藍(lán):5%氨水返藍(lán)5 s，流水沖洗。⑥ 復(fù)染:HE染液復(fù)染20 min，吸掉染液，蒸餾水洗掉未結(jié)合的染液。⑦ 拍照:倒置顯微鏡下200倍拍照。

1.2.5 AO染色 吖啶橙與細(xì)胞核內(nèi)DNA結(jié)合呈綠色熒光，與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)RNA結(jié)合呈橘紅色熒光。①24孔板細(xì)胞貼壁3～4 h后，棄掉10%新生牛血清培養(yǎng)液;按實驗分組每孔加入400μl含不同濃度血清的RPMI1640培養(yǎng)液;②37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)2、4、6、8 d，并取細(xì)胞培養(yǎng)板檢測棄掉培養(yǎng)液，PBS沖洗，避光，每孔加入200μl吖啶橙染液，搖床振蕩染色5 min。③去染液，PBS沖洗2次，搖床振蕩，每次5 min。④吸盡液體，熒光顯微鏡下藍(lán)光激發(fā)200倍拍照。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)實驗結(jié)果 見圖1。

2.1.1 HE染色 在同一生長時間下，無血清組細(xì)胞變圓、核固縮，很多細(xì)胞核呈現(xiàn)不規(guī)則形狀且被深染，僅存幾個細(xì)胞形態(tài)正常。隨著血清濃度的升高，細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)正常，但100%血清濃度組細(xì)胞凋亡現(xiàn)象較為嚴(yán)重，細(xì)胞變圓、凋亡核固縮比較明顯。隨著生長時間的增加，各20%、40%、60%血清組細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)增加趨勢，細(xì)胞形態(tài)也大多正常;80%血清組細(xì)胞出現(xiàn)空泡化現(xiàn)象，100%血清組細(xì)胞空泡化現(xiàn)象非常嚴(yán)重。

2.1.2 AO染色 在同一培養(yǎng)時間下，無血清組細(xì)胞大部分核固縮為半月形，極少數(shù)保持原有細(xì)胞形態(tài)且質(zhì)中有RNA的存在;而隨著血清濃度的增加，細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)較快，固縮半月形細(xì)胞核的比例也很快減少，質(zhì)中RNA的存在也表明細(xì)胞大部分處于增殖生長的階段;而高濃度血清組細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變，凋亡細(xì)胞核固縮比例增加，很多細(xì)胞核呈亮染半月形。隨著生長時間的增加，細(xì)胞在大量增殖的同時，由染色圖片可看出，細(xì)胞形態(tài)開始發(fā)生不規(guī)則改變，大量細(xì)胞亮染、核固縮并出現(xiàn)凋亡小體。

圖1 不同血清濃度、不同生長時間AO和HE染色細(xì)胞形態(tài)(×200)

2.2 SRB法測定細(xì)胞生長曲線實驗結(jié)果

2.2.1 血清濃度對細(xì)胞生長的影響 20%組和40%組細(xì)胞可以正常生長，隨著血清濃度的增加，特別是血清濃度達(dá)到60%及以上，對細(xì)胞生長產(chǎn)生明顯的抑制作用。其中，0%組OD值明顯低于其他濃度組，可見0%組對細(xì)胞生長有較強(qiáng)的抑制作用;而20%組相對于0%組而言，OD值呈現(xiàn)快速增加趨勢，對細(xì)胞促進(jìn)作用較強(qiáng);20%組和40%組OD值沒有明顯的趨勢變化，此間血清濃度變化對細(xì)胞的生長影響不是太大。此后，在相同的培養(yǎng)時間下，隨著血清濃度的升高，SRB法測定細(xì)胞的OD值逐漸減小，對細(xì)胞生長具有抑制作用，尤其是100%血清組抑制作用較為明顯。見圖2。

2.2.2 生長時間對細(xì)胞生長的影響 在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)時間內(nèi)，隨著細(xì)胞生長時間的延長，除0%組OD值無明顯變化只呈現(xiàn)微弱的降低趨勢外，其余濃度組OD值一直處于增加狀態(tài);各濃度組OD值在4 d之內(nèi)增加迅速，細(xì)胞生長較快;生長時間在4～6 d時，OD值增加趨勢較弱;6～8 d時，增加趨勢又有所增強(qiáng);其中，100%組OD值在此期間(4～6 d)增加趨勢非常明顯，細(xì)胞生長很快。見圖3。

圖2 血清濃度對細(xì)胞生長影響柱形圖

圖3 生長時間對細(xì)胞生長影響柱形圖

3 討論

皮膚衰老是隨著年齡增長而發(fā)生的皮膚生理性衰老，與真皮成纖維細(xì)胞減少、衰老密切相關(guān)〔3〕。成纖維細(xì)胞是普遍存在于結(jié)締組織中的一種中胚層來源的細(xì)胞，細(xì)胞較大，輪廓清楚，多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結(jié)構(gòu)，其細(xì)胞核呈規(guī)則的卵圓形，核仁大而明顯，其基本功能是合成和分泌膠原蛋白、彈性蛋白和葡聚糖、糖蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分和細(xì)胞因子，同時在傷口愈合過程中可遷移到傷口進(jìn)行增殖。異體真皮衍生物(dermalogen)、透明質(zhì)酸、微?；愺w真皮(alloderm)等在臨床中的應(yīng)用皆存在各種問題的出現(xiàn)，從而限制了其發(fā)展。

血清中含有豐富的氨基酸、肽類、蛋白質(zhì)、核酸及其關(guān)聯(lián)物質(zhì)、糖類、脂類、微量元素、某些維生素及其他有機(jī)物，這些物質(zhì)是細(xì)胞生存和生長所需微環(huán)境的重要條件之一。而血清中的多種生長因子，包括成纖維細(xì)胞生長因子、表皮生長因子、血小板生長因子、神經(jīng)生長性因子等能夠特異性與目的細(xì)胞膜上受體結(jié)合，并通過細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路促進(jìn)和加快細(xì)胞的增殖及生長代謝及相關(guān)因子的表達(dá)。例如，堿性成纖維細(xì)胞生長因子就是一類能促進(jìn)來源于中胚層和神經(jīng)外胚層細(xì)胞有絲分裂并誘導(dǎo)其分化的多肽生長因子。除此之外，一些微量元素和離子，如Zn、Se、Mn、Ge等，可作為某些重要酶的輔基在代謝解毒及抗氧化等方面起重要作用。正是由于血清具有這些多樣性的生物學(xué)特性，使其越來越多地應(yīng)用于多種細(xì)胞的體外培養(yǎng)，例如成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等。血清多樣性的生物學(xué)特點可以促進(jìn)中胚層細(xì)胞(包括成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等)分裂增殖，同時促進(jìn)新生細(xì)胞和有活力細(xì)胞的數(shù)量不斷增多，不斷產(chǎn)生膠原蛋白、彈性蛋白、透明質(zhì)酸、皮膚素等成分。雖然血清富含營養(yǎng)成分，具有豐富的生物學(xué)特性，但是如何使體外培養(yǎng)條件達(dá)到體內(nèi)環(huán)境的標(biāo)準(zhǔn)仍然是目前所面臨的問題。原因在于血清成分和生物學(xué)作用復(fù)雜，血清濃度過小時促貼壁和擴(kuò)展因子、黏附因子、結(jié)合蛋白等物質(zhì)缺失〔4〕，從而造成細(xì)胞衰老、細(xì)胞附著性降低、細(xì)胞核裂解空泡化或胞質(zhì)顆粒變性等;而血清濃度過大可能會造成成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)所需營養(yǎng)不足，且其含有的細(xì)胞毒性物質(zhì)和抑制物質(zhì)對細(xì)胞有去分化作用，可能影響某些細(xì)胞功能的表達(dá)。Ojeh等〔5〕認(rèn)為成纖維細(xì)胞在100 ml/L血清濃度培養(yǎng)基中生長良好，但劉鵬等〔6〕人認(rèn)為豬和鼠的成纖維細(xì)胞在這種培養(yǎng)基中狀態(tài)不良，易老化，不能取得令人滿意的效果。與此同時，成纖維細(xì)胞的倍增時間較短，一般3～4 d可傳一代，但除了在不同血清濃度下同一生長時間成纖維細(xì)胞生長情況不同外，在相同血清濃度下、不同生長時間下，成纖維細(xì)胞生長情況也不同。

本實驗在不同血清濃度(0%，20%，40%，60%，80%，100%)及不同生長時間(2，4，6，8 d)條件下，比較體外培養(yǎng)小鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞系生長曲線和細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果可見在相同生長時間下，0%組對細(xì)胞生長有較強(qiáng)的抑制作用，20%、40%對細(xì)胞均有較強(qiáng)促進(jìn)作用;而當(dāng)血清濃度超過60%，SRB法測定細(xì)胞的OD值逐漸減小，對細(xì)胞生長具有抑制作用，尤其是100%血清組抑制作用較為明顯。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，無血清組(0%)幾乎無正常形態(tài)細(xì)胞，20%、40%、60%的血清濃度中，細(xì)胞形態(tài)逐漸恢復(fù)正常;而超過60%的血清濃度會造成細(xì)胞凋亡。而隨著生長時間的增加，各濃度組OD值在4 d之內(nèi)增加迅速，細(xì)胞生長較快。高濃度的血清組可見細(xì)胞凋亡。本實驗結(jié)果說明，如果從血清濃度和細(xì)胞生長時間等綜合因素考慮，當(dāng)血清濃度為20%、40%、60%，細(xì)胞生長時間為2～4 d時，成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)環(huán)境較佳。因此，在利用血清進(jìn)行成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)時，應(yīng)充分考慮血清濃度和細(xì)胞生長時間對細(xì)胞生長和形態(tài)的影響。

然而，本實驗尚未對細(xì)胞培養(yǎng)后培養(yǎng)液中血清蛋白、細(xì)胞因子、無機(jī)元素和pH值等進(jìn)行測定，因此，目前尚未知成纖維細(xì)胞培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物或表達(dá)產(chǎn)物釋放到細(xì)胞培養(yǎng)液后是否會引起其pH值、血清濃度及其他成分變化。特別是，此階段的實驗研究尚未知成纖維細(xì)胞培養(yǎng)過程中是否出現(xiàn)其代謝產(chǎn)物或表達(dá)產(chǎn)物的改變，如是否會影響到成纖維細(xì)胞通過攝取所需的氨基酸、在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核蛋白體上合成前α多肽鏈、多肽鏈輸送到高爾基復(fù)合體后組成前膠原分子、前膠原分子由分泌囊泡帶到細(xì)胞表面，然后通過胞吐作用釋放到細(xì)胞外等生物學(xué)過程，而這個過程是否出現(xiàn)不同膠原蛋白亞型及其比值的改變，將是下一步深入探索和研究的內(nèi)容和方向。

1 Crowston JG，Wang XY，Khaw PT，et al.Human serum reduces mitomycin-C cytotoxicity in human tenon's fibroblasts〔J〕.Invest Ophthalmol Vis Sci，2006;47(3):946-52.

2 楊永鵬，董 萍，丁克祥，等.不同血清濃度及介質(zhì)對體外培養(yǎng)小鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞系生長曲線和細(xì)胞形態(tài)的影響〔J〕.國際老年醫(yī)學(xué)雜志，2010;31(6):241-9.

3 McCullough JL，Kelly KM.Prevention and treatment of skin aging〔J〕.Ann N Y Acad Sci，2006;10(1067):323-31.

4 劉 蘋，李 平，周元國，等.血清濃度對TGF-β1刺激成纖維細(xì)胞增殖的影響〔J〕.西南軍醫(yī)，2008;10(5):1-3.

5 Ojeh NO，F(xiàn)rame JD，Navsaria HA.In vitro characterization of an artificial dermal scaff old〔J〕.Tissue Eng，2001;7(4):457-9.

6 劉 鵬，金 巖，劉 源，等.不同種屬真皮成纖維細(xì)胞在不同血清濃度培養(yǎng)基中生長的比較觀察〔J〕.實用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2004;20(1):16-9.