褪黑素對(duì)大鼠肝微粒體細(xì)胞色素P450酶亞型CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4活性的影響

劉明遠(yuǎn) 楊光遠(yuǎn) 王躍新 張春斌 白 雪 張建華

(佳木斯大學(xué)藥理學(xué)教研室，黑龍江 佳木斯 154007)

褪黑素(Melatonin，MT)，是由哺乳動(dòng)物和人松果體分泌的一種胺類激素，主要經(jīng)細(xì)胞色素(CY)P1A2和CYP2C19代謝，具有鎮(zhèn)靜催眠、抗應(yīng)激、抗衰老、增強(qiáng)免疫、抗腫瘤等作用〔1～3〕。明確MT對(duì)CYP450酶各亞型的影響，對(duì)了解其與臨床其他藥物的相互作用、指導(dǎo)臨床合理用藥具有重要的意義。關(guān)于MT對(duì)肝微粒體酶活性影響的研究，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)鮮見報(bào)道。本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MT對(duì)大鼠CYP450含量和CYP1A2、CYP2C19活性無(wú)影響。本研究應(yīng)用甲苯磺丁脲、異喹胍和咪達(dá)唑侖為CYP450同工酶選擇性探針底物，進(jìn)一步觀察MT對(duì)大鼠肝微粒體CYP450酶亞型CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4活性的誘導(dǎo)和/或抑制作用，為臨床用藥及相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 Wistar大鼠，清潔級(jí)，體重180～250 g〔購(gòu)自佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào):SYXK(黑)2006-004〕。

1.1.2 主要試劑與儀器 MT(含量＞98%，多多藥業(yè)有限公司);甲苯磺丁脲、4'-羥基甲苯磺丁脲、異喹胍、4'-羥基異喹胍、咪達(dá)唑侖、1'-羥基咪達(dá)唑侖(Sigma公司);Aligent 6310質(zhì)譜儀、Agilent 1200高效液相色譜系統(tǒng)(美國(guó)Agilent公司);752型紫外分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 給藥方案 健康Wistar大鼠24只，雄性，隨機(jī)分成三組，每組8只。對(duì)照組，灌胃給予生理鹽水，連續(xù)給藥7 d;MT給藥組，每日灌胃給予MT(0.54 mg/kg)，連續(xù)給藥7 d;苯巴比妥誘導(dǎo)組，自MT給藥組給藥的第5天開始每日腹腔注射苯巴比妥鈉75 mg/kg，連續(xù)給藥3 d。

1.2.2 肝微粒體的制備 動(dòng)物拉頸椎處死，取出肝臟，立即放于冰冷的0.25 mol/L蔗糖溶液(pH7.4)中清洗，剪碎，清洗至無(wú)血色;取肝重2 g，加1 ml蔗糖溶液，在冰浴中用組織勻漿機(jī)制成勻漿;4℃20 000 r/min離心20 min，上清液100 000 r/min離心60 min，沉淀用0.1 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.4)懸浮均勻，保存于－80℃。

1.2.3 蛋白濃度測(cè)定 依據(jù)Lowry等方法〔4〕測(cè)定。取牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，與銅試劑、Folin phenol試劑反應(yīng)后，測(cè)750 nm吸收度，以蛋白濃度C對(duì)吸收度A進(jìn)行線性回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線。肝微粒體樣品用0.5 mol/L NaOH稀釋適當(dāng)倍數(shù)后同法操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。

1.2.4 CYP2C9活性測(cè)定 選擇甲苯磺丁脲作為特異性底物，參照文獻(xiàn)方法，建立孵化體系及定量測(cè)定4'-羥基甲苯磺丁脲的分析方法〔5，6〕。孵化體系中含大鼠肝微粒體蛋白1.0 mg/ml、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)1.0 mmol/L、MgCl210.0 mmol/L、KCl 10.0 mmol/L、甲苯磺丁脲 30.0 μmol/L，以Tris-HCl緩沖液(pH7.4)定容至500μl，孵化體系中甲醇的終濃度為0.06%，孵化10 min，取樣100μl，加入到200μl冰冷的甲醇中終止反應(yīng)。樣品處理后，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1.2.5 CYP2D6活性測(cè)定 選擇異喹胍作為其特異性底物，參照文獻(xiàn)方法建立定量測(cè)定4'-羥基異喹胍的分析方法〔7〕，孵化體系同1.2.4，異喹胍濃度為50μmol/L，孵化體系中甲醇的終濃度為0.1%。樣品處理后，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1.2.6 CYP3A4活性測(cè)定 選擇咪達(dá)唑侖作為其特異性底物，參照文獻(xiàn)方法建立定量測(cè)定1'-羥基咪達(dá)唑侖的分析方法〔8〕，孵化體系同1.2.4，咪達(dá)唑侖濃度為100 μmol/L，孵化體系中甲醇的終濃度為1%。樣品經(jīng)處理后，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)資料采用x±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

以各探針?biāo)幬锏拇x產(chǎn)物的產(chǎn)率 (nmol·mg protein－1·min－1)作為酶活性指標(biāo)。MT給藥組和對(duì)照組大鼠肝微粒體CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4活性見表1。兩組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)，說(shuō)明MT對(duì)CYP2C9、CYP2D6、CXP3A4亞型活性沒有抑制或誘導(dǎo)作用。

表1 對(duì)照組、MT組 CYP2C9、CYP2D6及CYP3A4 活性(nmol·mg protein－1·min－1，x±s)

3 討論

MT是一種由松果體分泌的神經(jīng)激素，具有調(diào)節(jié)睡眠的作用，分泌規(guī)律呈夜峰晝谷。青春期后，分泌量隨年齡增長(zhǎng)而逐漸下降〔9〕。到中老年時(shí)期，體內(nèi)分泌的MT水平明顯下降，從而使大多數(shù)中老年人倍受失眠之苦。失眠癥是臨床上一種常見的疾病，如果得不到有效地控制，可進(jìn)一步發(fā)展為重度抑郁癥〔10〕。在改善睡眠方面，MT呈現(xiàn)明顯的優(yōu)勢(shì)，至今，仍有很多人選擇MT改善睡眠質(zhì)量。

藥物代謝性相互作用是指同時(shí)或先后序貫使用2種或2種以上藥物時(shí)，因代謝環(huán)節(jié)的影響導(dǎo)致療效增強(qiáng)或降低。多種藥物合用時(shí)，代謝性相互作用發(fā)生率高達(dá)藥物相互作用的40%，具有非常重要的臨床意義。代謝性藥物相互作用最常見的原因是CYP450的誘導(dǎo)和抑制。由于老年人除失眠外常合并其他軀體疾病，MT與其他藥物合用在老年人中較為常見。因此，研究MT對(duì)肝微粒體CYP450酶的影響具有十分重要的意義。CYP450酶根據(jù)其氨基酸序列不同分為不同亞型，人體主要有5 種CYP450 酶，即CYP1A2、CYP2D6、CYP3A4、CYP2C9 和CYP2C19。這5種CYP450酶可以代謝約99%的通過(guò)CYP450酶代謝的藥物〔11〕。本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MT對(duì)大鼠CYP1A2、CYP2C19活性無(wú)影響。為了更全面掌握 MT對(duì)CYP450酶的作用，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了 MT對(duì)肝微粒體CYP450酶CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4活性的影響，為臨床安全聯(lián)合用藥提供理論依據(jù)。

本試驗(yàn)以0.54 mg/kg體重(相當(dāng)于人體推薦用量)劑量的MT原料藥連續(xù)給大鼠灌胃 7 d，測(cè)定MT直接給藥對(duì)大鼠CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4活性的影響。結(jié)果顯示:Wistar大鼠經(jīng)過(guò)MT處理后，與對(duì)照組比較，CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4活性均沒有變化，提示當(dāng)MT與某些主要經(jīng)CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4代謝的藥物合用時(shí)，發(fā)生代謝性藥物相互作用的可能性較小。

利用探針?biāo)幬餃y(cè)定催化特定底物的CYP450酶活性，可用于分析和比較不同個(gè)體中酶活性的差異，為臨床安全合理用藥提供科學(xué)依據(jù)〔12〕。本實(shí)驗(yàn)分別以甲苯磺丁脲、異喹胍、咪達(dá)唑侖為CYP2C9、CYP2D6和CYP3A4的特異性底物，通過(guò)代謝產(chǎn)物的生成速度來(lái)評(píng)價(jià)酶的活性。高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)靈敏度高、選擇性好，在藥物分析領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，本試驗(yàn)采用高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定4'-羥基甲苯磺丁脲、4'-羥基異喹胍和1'-羥基咪達(dá)唑侖含量，快速、靈敏、簡(jiǎn)便。

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