大黃蟄蟲丸對動脈粥樣硬化模型大鼠內(nèi)皮功能的影響

張艷慧 司秋菊 郭素麗 王艷娜 王鑫國 王貴娟 江玉娟 曹 剛

(河北醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，河北 石家莊 050091)

大黃蟄蟲丸出自漢張仲景著《金匱要略·血痹虛勞病脈癥并治第六》中，由熟大黃、黃芩、生地黃、蟄蟲、水蛭、蠐螬、虻蟲、桃仁、杏仁、芍藥、干漆、甘草十二味藥物組成，具有疏通經(jīng)絡(luò)、破瘀生新、緩中補虛之功效。以往該方在臨床上主要用于肝炎、肝硬化的治療，近年來，本著中醫(yī)異病同治的原則，在防治動脈粥樣硬化(AS)中也取得了較好的療效。本實驗主要從大黃蟄蟲丸對內(nèi)皮功能的影響來進一步的探討其抗AS作用機制，為該藥臨床療效提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD雄性大鼠40只，體重220～300 g，普通型，由河北省實驗動物中心提供。

1.2 主要藥物和試劑 大黃蟄蟲丸購自徐州頤海藥業(yè)有限公司，批號:060402。實驗前將藥物分別研成粉劑按計量比配制成兩個濃度混懸液(0.7 g/kg，1.4 g/kg)以備使用。血脂康膠囊由北京北大維信生物科技有限公司生產(chǎn)，批號:20061211?？偰懝檀?TC)，甘油三酯(TG)，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司;內(nèi)皮素(ET)，一氧化氮(NO)測試盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 方法

1.3.1 動物模型的建立 參照文獻方法復(fù)制大鼠AS模型〔1〕。飼喂基礎(chǔ)飼料的大鼠常規(guī)觀察1 w隨機分5組，對照組、模型組、大黃蟄蟲丸高劑量組、大黃蟄蟲丸低劑量組、陽性對照組。除對照組給予基礎(chǔ)飼料外，其余各組飼喂高脂飼料(配方1%膽固醇、0.35%膽酸、5%煉制豬油、0.1%丙硫氧嘧啶及基礎(chǔ)飼料)的大鼠按70萬單位維生素D3/kg的總計量分3 d腹腔注射，對照組同時給予等體積的生理鹽水腹腔注射，連續(xù)觀察21 d。對照組、模型組:每天灌胃蒸餾水(1 ml/100 g)，大黃蟄蟲丸高劑量組:大黃蟄蟲丸混懸液1.4 g生藥/kg灌胃，大黃蟄蟲丸低劑量組:大黃蟄蟲丸混懸液0.7 g生藥/kg灌胃，陽性對照組:血脂康膠囊0.3 g/kg灌胃，再觀察8 w。

1.3.2 生化指標的檢測 實驗結(jié)束后大鼠斷頭取血，低溫離心，3 000 r/min;15 min分離血清，血脂采用酶法;丙二醇(MDA)采用硫代巴比妥酸比色法;超氧化物歧化酶(SOD)采用黃嘌呤氧化酶法;NO采用硝酸還原法;ET采用放免法。

1.3.3 病理學(xué)觀察 標本處理及染色:處死大鼠并立即刨取主動脈弓，剝離外膜附著組織，置于10%甲醛固定，固定液固定24 h;70%酒精浸泡過夜;80%酒精浸泡2 h;95%酒精浸泡2次，每次1.5 h;純酒精浸泡2次，每次1.5 h;二甲苯1浸泡30 min;二甲苯2浸泡40 min;石蠟1，浸蠟30 min;石蠟2，浸蠟90 min;標本包埋;切片，60～70℃烤箱中烤片2 h，待染色。脫蠟至蒸餾水，Harris氏蘇木素(HE)染色，10 min;溫?zé)崃魉?自來水)沖洗2～5 min;1%鹽酸酒精分化(將切片浸入1～2次);自來水沖洗;0.1%氨水返藍;自來水充分沖洗;0.5%伊紅染2 min;水洗，脫水、透明、樹脂封固。顯微鏡下觀察病理變化。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用 SPSS1.10統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計。數(shù)據(jù)用x±s表示，采用組間對照t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 大黃蟄蟲丸對大鼠血脂的影響 模型組血清TG，TC，LDL-C含量比對照組明顯升高(P＜0.01，P＜0.05)，血清HDLC明顯降低(P＜0.01)，表明模型組出現(xiàn)脂代謝紊亂。大黃蟄蟲丸低劑量組與模型組對比TG，LDL-C明顯降低(P＜0.05);大黃蟄蟲丸高劑量組與模型組對比TG，TC，LDL-C明顯降低(P＜0.01，P＜0.05)，HDL-C含量明顯升高(P ＜0.01)，這表明大黃蟄蟲丸高、低劑量均有降血脂的作用。且大黃蟄蟲丸高劑量較低劑量作用更明顯。血脂康組TG，TC，LDL-1含量較模型組明顯降低(P＜0.01，P＜0.05)，與大黃蟄蟲丸低劑量組對比TC有顯著性差異(P＜0.05)，與大黃蟄蟲丸高劑量組對比HDL-C有顯著性差異。見表1。

表1 大黃蟄蟲丸對大鼠血脂的影響(x ±s，n=8，nmol/L)

2.2 大黃蟄蟲丸對大鼠血清NO、ET的影響 結(jié)果見表2。模型組血清NO水平較對照組顯著降低(P＜0.05)，ET水平明顯升高(P＜0.05);大黃蟄蟲丸高劑量組與模型組對比NO顯著升高，ET水平降低(P＜0.01，P＜0.05);而大黃蟄蟲丸低劑量組與模型組對比NO水平升高，ET水平降低但無顯著性差異，提示大黃蟄蟲丸高劑量組作用更明顯。血脂康組與模型組比較NO降低，ET升高有顯著性差異(P＜0.05)，與大黃蟄蟲丸高、低劑量組對比均無顯著性差異，其作用趨勢優(yōu)于大黃蟄蟲丸低劑量組，比大黃蟄蟲丸高劑量作用稍差。

表2 大黃蟄蟲丸對血清NO，ET的影響(x ± s，n=8)

2.3 主動脈病理檢查 正常對照組:各層結(jié)構(gòu)規(guī)整，內(nèi)膜無脂質(zhì)沉積改變，含少量膠原纖維和平滑肌纖維，彈力纖維分布均勻，未見異常改變。模型組:主動脈壁內(nèi)膜顯著增厚向管腔突起，病灶表面由纖維細胞、膠原纖維構(gòu)成纖維帽，其下方有脂質(zhì)、少許炎細胞，可見粥樣斑塊形成。大黃蟄蟲丸低劑量組:主動脈內(nèi)膜稍有增厚，病灶可見表層纖維帽較薄，其下為大量泡沫細胞。大黃蟄蟲丸高劑量組:主動脈內(nèi)膜無明顯增厚，平滑肌細胞排列較規(guī)整，但可見輕度水腫。未見膽固醇結(jié)晶，亦未見溶解壞死組織。血脂康組:主動脈內(nèi)膜無明顯增厚，彈力纖維形態(tài)稍迂曲。未見膽固醇結(jié)晶，亦未見溶解壞死組織。

3 討論

AS是一種與血脂異常及血管壁成分改變有關(guān)的動脈疾病?，F(xiàn)代研究表明，AS是一個緩慢而復(fù)雜的病理過程，各種機制(血脂異常等)導(dǎo)致內(nèi)皮細胞損傷，使內(nèi)皮細胞通透性增加，脂質(zhì)進入內(nèi)膜與細胞產(chǎn)生的氧自由基相結(jié)合，形成脂質(zhì)過氧化物從而促進脂質(zhì)過氧化，經(jīng)氧化修飾的脂蛋白又可以抑制內(nèi)皮細胞的代謝與增值〔2〕，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞氧化損傷，發(fā)生脂質(zhì)的沉積，加速了AS斑塊的形成。由動脈粥樣硬化所引起的疾病表現(xiàn)類似于中醫(yī)的胸痹、心痛、眩暈、中風(fēng)等病證。中醫(yī)學(xué)認為七情內(nèi)傷、氣機不暢、氣滯血瘀或飲食失節(jié)損傷脾胃，運化失調(diào)，津液化為痰濁，而致AS病癥的形成?？梢娧鎏底琛鉁鰹锳S形成的主要病機。

血管內(nèi)皮是覆蓋于所有血管內(nèi)側(cè)表面的單層扁平細胞，以往一直被認為僅起血管內(nèi)壁機械屏障作用，并表現(xiàn)為半透膜的功能。至今已被證實的內(nèi)皮功能包括調(diào)控血管張力及血液流動，參與血液與組織間的物質(zhì)交換，防止單核細胞與血管內(nèi)皮細胞(EC)發(fā)生黏附以及脂質(zhì)過氧化等。最近，人們更把EC看作是一個內(nèi)分泌組織及激素反應(yīng)組織，它可以產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)并發(fā)揮作用。不僅如此，EC還有多種激素的受體，這些受體除了具有將激素輸送至內(nèi)皮下的功能外，還參與了激素在細胞內(nèi)的信號傳遞過程〔3〕。

ET和NO是血管內(nèi)皮細胞分泌的一對最強的血管收縮和舒張因子，它們相互影響，相互制約，共同參與血管的正常舒縮，其水平異?；蚱胶馐д{(diào)與血管內(nèi)皮功能損傷有關(guān)。

ET是內(nèi)皮細胞合成的血管活性物質(zhì)，屬內(nèi)皮依賴性收縮因子，是至今發(fā)現(xiàn)的最強的縮血管物質(zhì)〔4〕。ET在正常人循環(huán)血漿水平很低，內(nèi)皮細胞主要向壁側(cè)分泌ET，作用于局部平滑肌。除具有強大的收縮血管的作用，ET還具有促進平滑肌細胞增殖等多方面的功能，加速了AS形成。高脂血癥和動脈粥樣硬化時，內(nèi)皮受損，可使ETmRNA的表達增強，ET的釋放增加，促進動脈粥樣硬化斑塊進一步增大。NO是內(nèi)皮細胞合成的生物活性物質(zhì)，屬內(nèi)皮依賴性舒張因子(EDRF)〔5〕。它是由L-精氨酸在NO合成酶催化下而生成。除具有強大的擴張血管作用，還具有防止血小板黏附、聚集，阻止單核細胞對血管內(nèi)皮的趨化，抑制平滑肌細胞增殖等作用。當(dāng)內(nèi)皮細胞受損時，NO合成減少，導(dǎo)致血管的舒張功能障礙，加速血小板的黏附和聚集，脂質(zhì)更易沉積和氧化，單核巨噬細胞對脂質(zhì)的吞噬作用增強，泡沫細胞形成增加，加速了動脈粥樣硬化的形成?，F(xiàn)在已把內(nèi)皮細胞釋放NO的能力作為判定內(nèi)皮功能的指標。

本實驗研究通過喂養(yǎng)法復(fù)制動脈粥樣硬化模型。大黃蟄蟲丸組方嚴謹，用藥精當(dāng)，是我國歷史悠久的驗方，本實驗挖掘中醫(yī)的潛力，光大經(jīng)方的作用，研究結(jié)果顯示該方可降低TC、TG、LDL，升高HDL。同時升高血清NO含量，降低ET含量，說明其可調(diào)節(jié)血脂異常，改善內(nèi)皮細胞功能，保護血管內(nèi)皮，從而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用。

1 溫進坤，韓 梅，杜瑋南，等.一種快速建立大鼠動脈粥樣硬化模型的實驗方法〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2001;21(1):50.

2 劉 飛，常 紅，謝鎮(zhèn)遠.氧化修飾低密度脂蛋白對血管內(nèi)皮細胞氧化損傷的研究〔J〕.衛(wèi)生研究，2004;33(1):89-91.

3 Harrison DG，Ohara Y.Physiologic consequences of increased vascular oxidantstresses in hypercholersterolemia and atherosclerosis implication for impaired vasomotion〔J〕.Am JCardiol，1995;75:75B-81B.

4 Anderson TJ，Meredith IT，Yeung AG，et al.The effecty of cholesterol lowering and antioxident therapy on endothelium dependent coronary vasomotion〔J〕.N EnglJMed，1995;332:488-93.

5 Yao SK，Akhtar S，Charru A，et al.Endogenous andexogenous nitrc oxide protect against intracoronary thrombosis and reoc-clusion after thrombolysis〔J〕.Circulation，1995;92(4):1005-10.