地西泮聯(lián)合亞低溫對大鼠腦缺血損傷病理的影響

邱小鷹 王 何 陳 紅 楊明秀 廖書勝

(廣西醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西 柳州 545001)

迄今為止，腦缺血后神經(jīng)保護(hù)治療還不能有效促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，目前的研究熱衷于綜合治療〔1～3〕，神經(jīng)保護(hù)劑聯(lián)合亞低溫治療可能是一種有效的治療方案。本實(shí)驗(yàn)觀察不同腦溫時(shí)地西泮治療大鼠局灶腦缺血光鏡、電鏡下的組織病理改變，探討地西泮聯(lián)合亞低溫治療對腦缺血損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及給藥方法 實(shí)驗(yàn)動物均為清潔級健康雄性Wistar大鼠，體重250～300 g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。20只大鼠隨機(jī)分為:假手術(shù)組(常溫)、腦缺血對照組(常溫)、輕度高溫地西泮組、常溫地西泮組、亞低溫地西泮組，共5組，每組各4只大鼠。輕度高溫、常溫、亞低溫地西泮組分別在大鼠腦缺血前30 min及腦缺血2 h再灌注即刻分兩次給予地西泮(10 mg/kg，腹腔注射給藥)，假手術(shù)組和腦缺血對照組分別給予腹腔注射相同次數(shù)和劑量的0.9%生理鹽水。

1.2 方法

1.2.1 腦溫監(jiān)控及維持 采用加溫及腦溫調(diào)節(jié)裝置〔4〕。腦溫以左側(cè)顳肌溫度間接反映。腦溫維持在39℃ ～39.5℃為輕度高溫，36.5℃ ～37℃為常溫，32℃ ～32.5℃為亞低溫。

1.2.2 動物模型制備 手術(shù)參考改良的Nagasawa等人方法〔5〕，制備大鼠左側(cè)大腦中動脈(MCA)缺血再灌注線栓模型，20 min內(nèi)完成。MCA缺血2 h后將尼龍線抽出頸內(nèi)動脈(ICA)即可恢復(fù)MCA血供。MCA閉塞后10 min內(nèi)把腦溫誘導(dǎo)至目標(biāo)腦溫，并維持4 h實(shí)驗(yàn)后脫離溫度調(diào)節(jié)，讓大鼠自然復(fù)蘇。MCA閉塞后6 h將大鼠處死，進(jìn)行組織處理和染色。假手術(shù)組不將尼龍線插入ICA，其余操作同手術(shù)組。

1.2.3 光鏡標(biāo)本處理及染色 每組動物各取2只，經(jīng)4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液內(nèi)灌注固定，取腦繼續(xù)后固定，經(jīng)浸蠟包埋等步驟，以視交叉為基準(zhǔn)，制成5μm同一冠狀面石蠟切片，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡觀察、攝片。

1.3 電鏡標(biāo)本處理及染色 每組動物各取2只，經(jīng)2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液內(nèi)灌注固定，取左側(cè)額頂部大腦皮質(zhì)1～2 mm3繼續(xù)后固定，常規(guī)電鏡技術(shù)制備超薄切片，EM-10L型Epton電鏡觀察、攝片。

2 結(jié)果

2.1 光鏡觀察 攝于大腦皮質(zhì)第Ⅲ層，假手術(shù)組:神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常，胞漿豐富、均勻，核圓形或橢圓形。腦缺血對照組:神經(jīng)細(xì)胞固縮，嗜伊紅性，尼氏體分解，核漿分界不易辨認(rèn)，細(xì)胞周圍中度水腫，見于大腦皮質(zhì)全層。輕度高溫地西泮組:神經(jīng)細(xì)胞嚴(yán)重固縮、深染，尼氏體消失，核漿溶合、分辨不清，細(xì)胞周圍高度水腫，嗜伊紅神經(jīng)細(xì)胞主要見于大腦皮質(zhì)全層、尾狀核。常溫地西泮組:神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)改變與腦缺血對照組近似。亞低溫地西泮組:神經(jīng)細(xì)胞輕度皺縮、結(jié)構(gòu)較為完整，胞漿較為豐富，核漿分界易辨認(rèn)，細(xì)胞周圍輕度水腫，主要見于大腦皮質(zhì)第Ⅲ層。見圖1。

2.2 電鏡觀察 假手術(shù)組:神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常，胞膜、核膜完整，細(xì)胞器完好無損，異染色質(zhì)少、著色淺。腦缺血對照組:神經(jīng)細(xì)胞膜不完整，基質(zhì)空泡變，微細(xì)結(jié)構(gòu)大部分消失，染色質(zhì)邊集成塊，核質(zhì)部分溶解，核膜不完整，軸索部分崩解。輕度高溫地西泮組:神經(jīng)細(xì)胞膜消失，基質(zhì)空泡變加重，胞漿、核質(zhì)明顯溶解，所有微細(xì)結(jié)構(gòu)基本消失，核膜不完整，軸索崩解加重。常溫地西泮組:神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)改變與腦缺血對照組近似，但核質(zhì)溶解相對較輕。亞低溫地西泮組:腦組織病理損傷較輕，神經(jīng)細(xì)胞輪廓存在，基質(zhì)空泡變較輕，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)部分腫脹，線粒體部分空泡變，核質(zhì)分布均勻，核膜完整。見圖2。可見，隨腦溫降低，缺血腦組織病理損傷范圍及程度呈依次減輕趨勢。

圖1 各組腦組織光鏡觀察(HE，×40)

圖2 各組腦組織電鏡觀察(×6 300)

3 討論

腦缺血神經(jīng)保護(hù)涉及多種治療方案，如單用或多種治療方法聯(lián)合應(yīng)用，以對抗腦缺血導(dǎo)致的有害生物化學(xué)及分子事件〔3〕。地西泮是苯二氮艸卓受體完全激動劑，與神經(jīng)細(xì)胞γ-氨基丁酸(GABA)受體相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合，產(chǎn)生抑制性突觸后電位、突觸后神經(jīng)細(xì)胞放電抑制，對缺血神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。研究表明:地西泮可減少腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞丟失〔6〕，地西泮至少在腦缺血后35 d內(nèi)對神經(jīng)細(xì)胞有保護(hù)作用〔7〕，地西泮可阻止沙土鼠腦缺血后錐體細(xì)胞嚴(yán)重結(jié)構(gòu)異常、錐體細(xì)胞變性及神經(jīng)細(xì)胞樹突損害〔8〕。亞低溫對缺血神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用〔4〕，其機(jī)制涉及多方面〔1，9，10〕，臨床研究表明在卒中事件中亞低溫治療應(yīng)盡早進(jìn)行〔1〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:①腦缺血后，地西泮的神經(jīng)保護(hù)作用受不同腦溫影響;②輕度高溫或常溫狀態(tài)下應(yīng)用地西泮治療均不能改善缺血腦組織病理學(xué)特征，對缺血腦組織均沒有保護(hù)作用;地西泮聯(lián)合亞低溫治療明顯改善缺血腦組織病理學(xué)特征，從而增強(qiáng)對缺血腦組織的保護(hù)。研究表明:常溫狀態(tài)下地西泮對缺血神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用有限〔11〕，地西泮誘導(dǎo)的GABA(A)活性增加不能有效保護(hù)常溫狀態(tài)下腦缺血所致的神經(jīng)細(xì)胞損傷〔12〕，而32℃亞低溫狀態(tài)下地西泮對缺血神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用增強(qiáng)〔11，12〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，腦缺血后，亞低溫與其他神經(jīng)保護(hù)治療相結(jié)合有可能成為一種有效的理想的神經(jīng)保護(hù)治療方法。

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