靈芝孢子粉對(duì)戊四氮致癇大鼠腦組織NO和NOS的影響

王偉群 張明亮 于海波 李 晶 王顯鋼 王淑秋

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

流行病學(xué)調(diào)查顯示，全球癲癇患病率約為5‰，兒童和老年人是癲癇的高發(fā)人群。我國(guó)目前約有900萬(wàn)癲癇病人，并且每年有45萬(wàn)新生病例發(fā)生，其已成為嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一。靈芝孢子粉(Ganoderma lucidum spores)具有免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)、清除自由基、提高機(jī)體耐缺氧能力等作用，之前研究還顯示其在抗癲癇方面也有明顯療效〔1〕。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行靈芝孢子粉對(duì)戊四氮所致癲癇大鼠腦組織NO和NOS表達(dá)的影響，旨在進(jìn)一步闡明靈芝孢子粉的抗癲癇作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要藥品、試劑與儀器 戊四氮(PTZ)，Sigma公司;靈芝孢子粉，佳木斯市野生靈芝種植基地;一氧化氮測(cè)試盒和一氧化氮合成酶測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所;電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)，寧波新芝科器研究所;S22PC型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司。

1.2 動(dòng)物分組及模型的建立 健康、雄性Wistar大鼠30只，初始體重(150±10)g(由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，隨機(jī)平均分成正常對(duì)照組、靈芝孢子粉組和癲癇組。靈芝孢子粉組和癲癇組每日由腹腔注射PTZ，32 mg/kg，連續(xù)注射28 d后停止給藥，1 w后再以上述劑量的PTZ點(diǎn)燃，選擇點(diǎn)燃后凡連續(xù)出現(xiàn)5次Ⅱ級(jí)以上癥狀并存活的動(dòng)物做后續(xù)實(shí)驗(yàn);與此同時(shí)，正常對(duì)照組每日腹腔注射相同體積生理鹽水。從腹腔注射當(dāng)天開始，靈芝孢子粉組用靈芝孢子粉灌胃，正常對(duì)照組和癲癇組用生理鹽水灌胃，每日一次，灌胃體積均為1.0 ml/次。大鼠癲癇發(fā)作采用Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):0級(jí):無(wú)任何反應(yīng);Ⅰ級(jí):嘴或(及)面部發(fā)生節(jié)律性抽動(dòng);Ⅱ級(jí):面部抽動(dòng)并伴有節(jié)律性點(diǎn)頭;Ⅲ級(jí):Ⅱ級(jí)伴有雙前肢抽搐;Ⅳ級(jí):四肢抽搐;Ⅴ級(jí):全身性強(qiáng)直陣攣發(fā)作。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，所有動(dòng)物均迅速斷頭，于低溫環(huán)境下取腦、勻漿，并收集上清液備用。

1.3 腦組織NO含量的測(cè)定 采用比色法測(cè)定，NO化學(xué)性質(zhì)活潑，在體內(nèi)代謝很快并轉(zhuǎn)為 NO-2和 NO-3，而 NO-2又進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為NO-3，利用硝酸還原酶特異性將NO-3還原為NO-2，通過(guò)顯色深淺測(cè)定其濃度的高低。具體操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，NO含量計(jì)算公式如下。NO含量(μmol/gprot)=×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(20μmol/L)÷樣本的蛋白含量(gprot/L)。

1.4 腦組織NOS測(cè)定 采用比色法測(cè)定，NOS催化L-Arg分子氧反應(yīng)生成 NO，NO與親核性物質(zhì)生成有色化合物，在530 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，根據(jù)吸光度的大小可計(jì)算出NOS的活力。具體操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，NOS含量計(jì)算公式如下。NOS (U/mgprot)

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行組間q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

靈芝孢子粉組和癲癇組所有動(dòng)物均點(diǎn)燃成功，并經(jīng)測(cè)試均可發(fā)生連續(xù)5次Ⅱ級(jí)以上癲癇發(fā)作，主要發(fā)生在PTZ腹腔注射后4 min內(nèi)，且發(fā)作程度不一。大發(fā)作的典型癥狀為首先出現(xiàn)面部和嘴部的陣攣、點(diǎn)頭、甩尾，進(jìn)而發(fā)生前肢的陣攣抽搐并逐漸加重，最終導(dǎo)致四肢抽搐、不能站立、摔倒翻滾;正常對(duì)照組動(dòng)物整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未出現(xiàn)任何級(jí)別的癇樣發(fā)作。大鼠腦組織NO、NOS水平，正常對(duì)照組低于靈芝孢子粉組(P＜0.05);靈芝孢子粉組低于癲癇組(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 腦組織NO、NOS含量(n=8，x±s)

3 討論

癲癇是由多種病因引起的腦部神經(jīng)元過(guò)度同步化放電，從而導(dǎo)致大腦短暫的功能障礙為主要特征的慢性臨床疾患。其發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，臨床上以肌肉抽搐和(或)意識(shí)喪失為其主要表現(xiàn)，另外還可表現(xiàn)為感覺(jué)、意識(shí)、行為和自主神經(jīng)功能等方面的障礙，具有發(fā)作性、復(fù)發(fā)性及通常能自限的特點(diǎn)。

NO作為一種活性很強(qiáng)的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間生物信使分子，是由NOS以L-精氨酸為底物催化產(chǎn)生的。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)NOS分布較廣泛，包括大腦皮質(zhì)、海馬和小腦都有其存在，因此這些區(qū)域也有NO大量表達(dá)〔2〕。

目前對(duì)NO與NOS在癲癇發(fā)作中的作用存在不同的觀點(diǎn)，認(rèn)為其既具有神經(jīng)保護(hù)作用，又具有神經(jīng)毒作用。一方面在致癇劑的作用下，NMDA受體被激活，Ca2+大量?jī)?nèi)流和細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高，導(dǎo)致Ca2+與CaM形成復(fù)合物，大量產(chǎn)生的Ca2+-CaM可激活NOS，促使合成過(guò)量的NO。NO通過(guò)以下機(jī)制發(fā)揮神經(jīng)毒作用。(1)NO介導(dǎo)Glu從突觸前膜釋放，激活突觸后膜上的NMDA受體離子通道開放和大量Ca2+內(nèi)流，加劇癲癇發(fā)作和惡性循環(huán);(2)NO可彌散到鄰近的星形膠質(zhì)細(xì)胞和突觸前末梢，激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(GC-S)，促使靶細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)表達(dá)增加，cGMP再激活cGMP依賴性蛋白激酶，促使蛋白磷酸化，操縱離子通道和GLu釋放，增加NMDA活性，發(fā)揮神經(jīng)毒性作用;(3)還原型NO-可與超氧陰離子發(fā)生反應(yīng)，生成過(guò)氧化亞硝酸，并在酸性環(huán)境中進(jìn)一步分解成具有很強(qiáng)毒性的羥基及二氧化氮自由基，導(dǎo)致質(zhì)膜破壞和功能失調(diào)，最終引起細(xì)胞電生理功能障礙從而參與癲癇持續(xù)狀態(tài)〔3，4〕。(4)NO還可活化ADP核糖環(huán)化酶，促使鈣庫(kù)釋放Ca2+。另一方面NO可能在NMDA受體興奮過(guò)程中起負(fù)反饋?zhàn)饔?，NMDA受體興奮引起的Ca2+內(nèi)流可以使細(xì)胞內(nèi)NOS合成NO增多，NO發(fā)過(guò)來(lái)可以對(duì)NMDA受體通道起抑制作用。原因是NMDA受體通道復(fù)合物的氧化還原調(diào)節(jié)位點(diǎn)含有一個(gè)或者數(shù)個(gè)游離巰基，NO與巰基發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生二硫化物，導(dǎo)致NMDA受體活性下降，Ca2+內(nèi)流減少，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用〔5〕。

目前認(rèn)為NO這種正反饋的作用只有在正常的生理水平上才發(fā)揮作用，正常情況下少量的Ca2+內(nèi)流可促使NOS生成NO增多，而增多的NO可導(dǎo)致NMDA受體活性下降，Ca2+內(nèi)流減少，從而維持一種平衡和穩(wěn)態(tài)，但如果細(xì)胞NO合成明顯增高，上述平衡會(huì)遭到破壞，引起神經(jīng)毒作用。本實(shí)驗(yàn)顯示，癲癇組NO與NOS含量可能已經(jīng)明顯高于負(fù)反饋調(diào)節(jié)范疇，因此其作為內(nèi)源性致癇物質(zhì)參與癲癇發(fā)作。靈芝孢子粉可抑制NMDA受體興奮，在降低Ca2+內(nèi)流同時(shí)也使NO與NOS水平下降，通過(guò)阻斷sGC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少自由基生成而達(dá)到治療癲癇作用。因此，靈芝孢子粉作為一種治療癲癇的候選輔助用藥，在臨床應(yīng)用上有著非常廣闊的應(yīng)用前景。

1 王偉群，王淑秋，劉月霞，等.靈芝孢子粉對(duì)癲癇大鼠腦組織IL-1β與c-Fos的影響〔J〕.中國(guó)病理生理雜志，2007;23(6):1149-52.

2 徐 霖，梁英武，宋秀玲.一氧化氮、一氧化氮合酶在遺傳性癲癇易感大鼠驚厥發(fā)作中的變化及作用〔J〕.中國(guó)行為醫(yī)學(xué)科學(xué)，2003;12(3):261-90.

3 彭化生.一氧化氮和癲癇〔J〕.國(guó)外醫(yī)學(xué)·神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)分冊(cè)，1997;24(1):7-9.

4 Small DL，Buchan AM.Mechanisms of cerebral ischemia:intracellular cascades and therapeutic interventions〔J〕.J Cardiothorac Vasc Anesth，1996;10(1):139-46.

5 Lei SZ，Pan ZH，Aggarwal SK，et al.Effect of nitric oxide production on the redox modulation site of the NMDA receptor-channel complex〔J〕.Neuron，1992;8(6):1087-99.