γ-分泌酶組件NCT在癡呆小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分布及表達(dá)

龍志敏 趙 蕾 賀桂瓊 宋 沖 楚亞楠

(重慶醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究中心，重慶 400016)

β淀粉樣蛋白(beta-Amyloid protein，Aβ)沉積形成的老年斑(senile plaques，SP)是阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的典型病理特征之一。Aβ來源于腦內(nèi)β-分泌酶和γ-分泌酶對(duì)淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor protein，APP)跨膜區(qū)的切割。Aβ主要有兩種形式:Aβ40和Aβ42(二者比例為9∶1)，其中Aβ42容易纖維化聚集形成具有毒性的低聚體，Aβ42產(chǎn)生過多極易導(dǎo)致SP的形成以及AD的發(fā)生。由于γ-分泌酶是催化Aβ生成的終末階段，且是決定Aβ40/Aβ42比例的關(guān)鍵酶，因此該酶目前已成為AD的潛在性治療靶點(diǎn)〔1〕?，F(xiàn)已證實(shí)γ-分泌酶是由早老素(Presenilin，PS)、前咽缺陷蛋白(Aph-1)、早老蛋白增強(qiáng)子2(Pen2)和單過性跨膜蛋白(Nicastrin，NCT)四種蛋白亞基構(gòu)成的一種多蛋白復(fù)合體〔2〕，其中PS是γ-分泌酶的活性中心〔3〕，但PS活性受γ-分泌酶其他組分的調(diào)控，其中最為密切的是NCT〔4〕。本文以不同發(fā)育階段的APP/PS1雙重轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠和同窩野生型小鼠為研究對(duì)象，采用形態(tài)學(xué)方法系統(tǒng)研究NCT在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的分布與表達(dá)，以期進(jìn)一步明確NCT的功能及與AD的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 APP/PS1雙重轉(zhuǎn)基因傳代小鼠的建立 將購于Jackson Lab雄性和雌性的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因雜合體種鼠B6C3-Tg(APPswe，PSEN1de9)85Dbo/J合籠，交配繁殖。產(chǎn)下的后代用PCR進(jìn)行基因分型。

1.1.2 試劑 兔抗NCT多克隆抗體(Convance公司);鼠抗PS單克隆抗體(abcam公司);小鼠抗Aβ單克隆抗體:靶向Aβ1～17的6E10，靶向Aβ17～24的4G8(Sigma公司);鼠抗 β-actin 單克隆抗體(Santa Cruz公司);羊抗兔和羊抗小鼠IgG二抗(Jackson Immunoreseach Laboratories，USA);DNA提取試劑盒(Tiangen公司);鏈霉親合素-生物素-過氧化物酶復(fù)合體(SABC)免疫組化試劑盒(北京中杉);二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒(Pierce，USA);其他均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 基因分型 對(duì)APP/PS1雙重轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行鑒定。剪子代小鼠鼠尾約0.5 cm，按照試劑盒(Tiangen公司)步驟提取基因組DNA，核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定濃度后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，紫外分析儀下觀察同時(shí)出現(xiàn)APP、PS1條帶的即為APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠。PCR擴(kuò)增:根據(jù)提供的引物擴(kuò)增APP和PS1，以β-actin為內(nèi)對(duì)照。APP引物上游:5'-CACCACAGAATCCAAGTCGG-3'，下游:5'-CTTGACGTTCTGGCCTCTTCC-3';PS1引物上游:5'-CAGGTGCTATAAGGTCAT-3'，下游:5'-ATCACAGCCAAGATGAGC-3';β-actin 引物上游:5'-GACAGGATGCAGAAGGAGAT-3'，下 游:5'-TTGCTGATCCACATCTGCTG-3'。PCR 反應(yīng)條件:94℃ ×5 min→(94℃ 30 s→58℃ 40 s→72℃ 40 s)共35個(gè)循環(huán)→72℃ 10 min(－20℃保存PCR產(chǎn)物)。APP基因PCR產(chǎn)物長350 bp，PS1擴(kuò)增片段長608 bp，β-actin 為446 bp。

1.2.2 動(dòng)物分組及處理 根據(jù)基因分型結(jié)果，APP/PS1基因陽性小鼠為AD模型組，同窩野生型小鼠為對(duì)照組。設(shè)置5個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)，分別為出生后 1 d、7 d、21 d、90 d和 180 d，記為P1、P7、P21、P90、P180。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色 小鼠腹腔注射2%水合氯醛麻醉成功后開胸，經(jīng)心臟灌注4%多聚甲醛固定后，取腦入多聚甲醛后固定8 h，常規(guī)脫水透明石蠟包埋，然后分別進(jìn)行冠狀和矢狀切片，厚度4μm。切片經(jīng)二甲苯脫蠟，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，微波煮沸抗原修復(fù)，自然冷卻，再經(jīng)3%H2O2處理15 min以封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，5%胎牛血清(BSA)封閉1 h后，加入Ⅰ抗，4℃過夜。Ⅱ抗和SP復(fù)合物于室溫孵育2 h。最后用DAB顯色。常規(guī)脫水、透明、封片，光鏡下觀察。

1.2.4 免疫熒光雙標(biāo) 切片脫蠟后，經(jīng)PBS沖洗3次，然后放入含0.3%TritonX-100的PBS中，室溫浸泡30 min，再用PBS沖洗3次，5%正常山羊血清室溫封閉1 h，然后加入Ⅰ抗:兔抗NCT抗體 (1∶200)及小鼠抗 PS1單克隆抗體(1∶1 000);或兔抗NCT抗體 (1∶200)及小鼠抗Aβ抗體6E10(1∶50)，孵育24 h(4℃)，PBS沖洗3次;加入Ⅱ抗:山羊抗兔 FITC(1∶400)和山羊抗小鼠TRITC(1∶400)，室溫孵育2～4 h;PBS沖洗;甘油封片。激光共聚焦熒光顯微鏡(Carl Zeiss MicroImaging，Inc.)觀察并采圖。陰性對(duì)照:免疫組化和免疫熒光染色時(shí)，用正常山羊血清代替I抗孵育APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠腦切片，經(jīng)上述免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色，未見明顯的特異性免疫陽性反應(yīng)產(chǎn)物。

2 結(jié)果

2.1 APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因癡呆小鼠的鑒定結(jié)果 雌性和雄性種鼠產(chǎn)下后代，剪鼠尾提取基因組DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后，1.5%瓊脂糖電泳結(jié)果:同時(shí)出現(xiàn) APP條帶(350 bp)和 PS1條帶(608 bp)的即為APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因陽性小鼠。見圖1。

2.2 NCT在成年APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因癡呆小鼠CNS各區(qū)域的分布 取出生后180 d的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因癡呆小鼠腦和脊髓進(jìn)行免疫組化，結(jié)果顯示:NCT陽性細(xì)胞廣泛分布于成年癡呆小鼠CNS各區(qū)域，包括大腦新皮質(zhì)、嗅腦、海馬、丘腦、紋狀體、小腦、腦干和脊髓等，其中NCT陽性反應(yīng)主要出現(xiàn)在神經(jīng)元，而未出現(xiàn)在膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)。癡呆小鼠大腦新皮質(zhì)的NCT陽性細(xì)胞主要分布于第Ⅳ、V層，而表層(I層)出現(xiàn)的NCT陽性細(xì)胞少;嗅腦內(nèi)的NCT陽性細(xì)胞主要分布于內(nèi)皮層的第Ⅱ?qū)?海馬內(nèi)的NCT陽性細(xì)胞主要出現(xiàn)在錐體細(xì)胞和顆粒細(xì)胞層;中腦黑質(zhì)區(qū)域出現(xiàn)NCT強(qiáng)陽性反應(yīng);隔區(qū)有中等強(qiáng)度的NCT陽性反應(yīng);紋狀體和丘腦內(nèi)僅呈弱陽性表達(dá);小腦內(nèi)的NCT陽性反應(yīng)以Purkinje細(xì)胞層表達(dá)較多，顆粒細(xì)胞層表達(dá)較弱;腦橋和延髓內(nèi)的神經(jīng)核團(tuán)(尤其是運(yùn)動(dòng)核)內(nèi)NCT表達(dá)非常明顯;第三、四腦室及側(cè)腦室脈絡(luò)叢出現(xiàn)NCT強(qiáng)陽性表達(dá);在脊髓灰質(zhì)前角、后角和側(cè)角及灰白質(zhì)交界的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)NCT呈強(qiáng)陽性表達(dá)，而白質(zhì)區(qū)域幾乎未見NCT陽性細(xì)胞。見圖2。

圖1 APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的基因分型電泳圖

2.3 NCT的分布與SP及Aβ分布的關(guān)系 免疫組化結(jié)果顯示，出生后180 d的成年癡呆小鼠CNS內(nèi)出現(xiàn)大量SP，其大小和形態(tài)不一，但染色較均勻。其中癡呆小鼠大腦新皮質(zhì)和海馬內(nèi)SP體積大、數(shù)量多、密集分布;腦室脈絡(luò)叢內(nèi)可見較多的陽性斑塊;小腦皮質(zhì)內(nèi)可見少量散在的SP分布;但腦干和脊髓內(nèi)未見SP。見圖3。為弄清細(xì)胞內(nèi)NCT與Aβ是否共存，實(shí)驗(yàn)中取成年癡呆小鼠的腦組織進(jìn)行了免疫熒光雙標(biāo)。結(jié)果顯示:癡呆小鼠腦部各區(qū)均出現(xiàn)大量NCT陽性細(xì)胞(綠色熒光)和Aβ陽性細(xì)胞(紅色熒光)，但在大腦皮質(zhì)和海馬內(nèi)NCT陽性神經(jīng)元的數(shù)量要多于Aβ陽性細(xì)胞，且在一些神經(jīng)元內(nèi)NCT與Aβ出現(xiàn)了共存。見圖4。

2.4 NCT與PS1在成年癡呆小鼠腦組織中的共存 免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示:PS1在成年APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因癡呆小鼠腦組織的分布趨勢(shì)同NCT的分布高度一致。不同的是，在神經(jīng)元內(nèi)PS1免疫陽性物在胞漿中表達(dá)較強(qiáng)，而NCT免疫陽性物在胞漿、胞膜均有強(qiáng)表達(dá)。見圖5。

圖2 NCT在APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠CNS各區(qū)域的分布

圖3 SP在APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠CNS各區(qū)域的分布(×100)

圖4 免疫熒光雙標(biāo)顯示

圖5 免疫熒光雙標(biāo)顯示

2.5 NCT在不同發(fā)育階段癡呆小鼠及同窩野生型小鼠腦內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布情況 出生后1 d(P1)的癡呆小鼠和同窩野生型小鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)NCT陽性神經(jīng)元排列致密，免疫陽性物質(zhì)主要分布于神經(jīng)元胞體，包括細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、核膜和突觸;隨著小鼠的發(fā)育，腦組織單位面積內(nèi)NCT陽性神經(jīng)元數(shù)量逐漸減少，一部分NCT逐漸被運(yùn)輸?shù)缴窠?jīng)元的樹突和神經(jīng)纖維網(wǎng)中，NCT免疫陽性物質(zhì)主要分布于細(xì)胞膜、部分細(xì)胞質(zhì)和突起，細(xì)胞膜染色較深，細(xì)胞質(zhì)染色較淺。與各年齡段野生型小鼠相比，癡呆小鼠腦內(nèi)NCT陽性神經(jīng)元的染色深度明顯高于野生型小鼠且癡呆小鼠腦內(nèi)NCT免疫陽性物質(zhì)在整個(gè)胞質(zhì)和突觸的分布更明顯。見圖6。

圖6 NCT在不同年齡段APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因及同窩野生型小鼠腦中分布及表達(dá)的比較(×400)

3 討論

NCT是2000年YU〔5〕等在純化PS片段時(shí)分離出的一種與γ-分泌酶功能和 Aβ產(chǎn)生有關(guān)的重要蛋白質(zhì)。近期研究發(fā)現(xiàn)〔6～8〕，NCT 缺乏會(huì)使 γ-分泌酶活性下降、Aβ 產(chǎn)生減少;過度表達(dá)的NCT可增加Aβ的生成;NCT胞外功能區(qū)DYIGS基序的人工缺失及人工誘導(dǎo)的突變產(chǎn)物會(huì)使Aβ尤其是Aβ42明顯增多。以上研究提示，NCT的結(jié)構(gòu)變異或表達(dá)水平的改變將導(dǎo)致Aβ生成量的異常，可能與AD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。AD可分為家族性(FAD)和散發(fā)性(SAD)兩種，F(xiàn)AD主要是常染色體顯性遺傳病，僅占全部AD的10%以下，目前已證實(shí)APP和PS的突變是引起FAD的主要原因;其余絕大多數(shù)AD屬散發(fā)性，由多因素引起。本實(shí)驗(yàn)采用的是APPswe/PS△E9雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型，APPswe是“瑞典家族”突變，突變發(fā)生在APP編碼序列末端，670、671位點(diǎn)，Lvs與 Met分別被 Asn與 Leu取代;PS△E9是在FAD中發(fā)現(xiàn)的第9外顯子缺失突變。攜帶APPswe和PS1突變基因的小鼠具有AD患者的特征性改變，包括空間學(xué)習(xí)和記憶障礙、SP沉積、神經(jīng)元丟失及反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞增生，被認(rèn)為是理想的AD動(dòng)物模型。

目前關(guān)于AD的發(fā)病機(jī)制形成了幾種學(xué)說，其中較為公認(rèn)的是“Aβ學(xué)說”，該學(xué)說認(rèn)為Aβ產(chǎn)生過多并沉積是引起AD的中心環(huán)節(jié)。Aβ是由APP經(jīng)β-分泌酶(BACE1)和γ-分泌酶相繼作用后產(chǎn)生。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道〔9～11〕，無論是AD患者還是轉(zhuǎn)基因AD模型鼠腦內(nèi)均出現(xiàn)了BACE1蛋白水平增多、β-分泌酶活性增強(qiáng)，但是否出現(xiàn)γ-分泌酶表達(dá)及活性的改變尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。γ-分泌酶是唯一負(fù)責(zé)I型跨膜蛋白(如APP、Notch、E-cadherin、ErbB-4等)延伸序列的細(xì)胞膜內(nèi)分裂的膜連蛋白。在γ-分泌酶復(fù)合體的四個(gè)組件蛋白，第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)且研究得最透徹的是PS。目前已證實(shí)PS1水解生成的PS1 CTF/NTF異二聚體是γ-分泌酶的催化活性中心，PS1的異常突變是引起家族性AD的主要原因。γ-分泌酶中第二個(gè)被發(fā)現(xiàn)且與PS1關(guān)系最密切的蛋白亞基是NCT，有證據(jù)顯示，NCT上有γ-分泌酶的底物結(jié)合位點(diǎn)〔12〕，參與 γ-分泌酶與底物的選擇性結(jié)合;最近研究還發(fā)現(xiàn)，NCT的胞外功能區(qū)可識(shí)別和結(jié)合γ-分泌酶的底物，被稱為γ-分泌酶的底物受體〔13〕。作為γ-分泌酶結(jié)合位點(diǎn)兼底物受體的NCT，其表達(dá)水平變化勢(shì)必影響底物(如sAPP)進(jìn)入γ-分泌酶的數(shù)量，進(jìn)而影響產(chǎn)物(如Aβ)的產(chǎn)量?？梢灶A(yù)見，通過有選擇性的調(diào)節(jié)NCT的表達(dá)水平來調(diào)控γ-分泌酶活性及Aβ的生成量，有望緩解AD癥狀，達(dá)到治療AD的目的。盡管目前國際上對(duì)NCT的研究在分子水平取得了不少進(jìn)展，但關(guān)于NCT在AD患者CNS中的分布及表達(dá)、NCT的分布與SP及Aβ分布的關(guān)系、NCT在AD患者及正常人腦組織中的分布和表達(dá)的差異等形態(tài)學(xué)方面的研究卻鮮有報(bào)道。

NCT主要由成纖維細(xì)胞和神經(jīng)元合成，在體內(nèi)廣泛分布。Hebert等〔14〕發(fā)現(xiàn)小鼠不同組織中 NCT mRNA的表達(dá)水平不同。NCT在小鼠肝臟、心臟、腎臟和睪丸中表達(dá)最高，骨骼肌表達(dá)最少，在腦中表達(dá)水平一般，但NCT在CNS各區(qū)域分布的情況如何尚無可知。本實(shí)驗(yàn)取出生后6個(gè)月的成年APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠的腦和脊髓進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NCT廣泛分布于癡呆小鼠腦和脊髓的各個(gè)區(qū)域，但不是均勻分布，其中NCT陽性神經(jīng)元在大腦新皮質(zhì)的第Ⅳ～V層、內(nèi)嗅皮質(zhì)第Ⅱ?qū)雍秃ｑR的錐體細(xì)胞和顆粒細(xì)胞層的分布最密集;其次在中腦黑質(zhì)區(qū)域、隔區(qū)、紋狀體、丘腦、小腦皮質(zhì)Purkinje細(xì)胞層、腦橋和延髓內(nèi)的神經(jīng)核團(tuán)(尤其是運(yùn)動(dòng)核)、各腦室脈絡(luò)叢及脊髓灰質(zhì)等有較多分布，這一結(jié)果與Kodama等〔15〕觀察到的NCT在正常小鼠CNS各區(qū)域分布的結(jié)果相似。

與NCT在CNS各區(qū)域的分布相比，神經(jīng)元外的SP在出生后6個(gè)月的成年癡呆小鼠CNS中的分布極為局限，主要選擇性分布于大腦新皮質(zhì)、內(nèi)嗅區(qū)及海馬等與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的區(qū)域，在側(cè)腦室脈絡(luò)叢及小腦皮質(zhì)有極少量的分布，而腦干及脊髓內(nèi)未見SP。既然NCT的分布比細(xì)胞外Aβ沉積的范圍廣，那么，在大腦皮質(zhì)與海馬區(qū)域，NCT是否與神經(jīng)元內(nèi)的Aβ共存?實(shí)驗(yàn)中通過免疫熒光雙標(biāo)發(fā)現(xiàn)，在大腦皮質(zhì)和海馬，NCT陽性神經(jīng)元的數(shù)量仍較Aβ陽性神經(jīng)元的數(shù)量多，幾乎所有Aβ陽性神經(jīng)元能與NCT陽性神經(jīng)元疊加，即神經(jīng)元內(nèi)的Aβ與NCT出現(xiàn)了共存，但有一部分NCT陽性神經(jīng)元內(nèi)并未出現(xiàn)Aβ，提示這部分NCT可能未參與Aβ的生成，即NCT除與Aβ的生成、AD的發(fā)生有關(guān)外，尚存在其他功能。在γ-分泌酶“四人家庭成員”中，NCT和PS1的關(guān)系尤為密切。已有不少研究以正常大鼠或細(xì)胞為研究對(duì)象，用分子生物學(xué)方法觀察到NCT與PS1之間形成了NCT-PS1復(fù)合物，且NCT的成熟依賴于PS1〔3〕，那么，在癡呆小鼠腦內(nèi)，NCT與PS1在分布上有怎樣的關(guān)聯(lián)呢?本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PS1在癡呆小鼠腦中的分布趨勢(shì)同NCT的分布高度一致，只是在神經(jīng)元內(nèi)的分布，PS偏重在胞質(zhì)表達(dá)，而NCT在胞質(zhì)、胞膜均有表達(dá)，且二者在神經(jīng)元內(nèi)共存。

為弄清NCT在癡呆小鼠與正常小鼠腦組織中的分布及表達(dá)是否存在差異，實(shí)驗(yàn)中取不同發(fā)育階段的APP/PS1雙重轉(zhuǎn)基因癡呆小鼠及同窩野生型小鼠的腦組織進(jìn)行了免疫組化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論是癡呆型還是野生型，新生小鼠腦內(nèi)的NCT陽性神經(jīng)元在大腦皮質(zhì)的分布密集;隨著小鼠的發(fā)育，單位面積內(nèi)NCT陽性神經(jīng)元數(shù)量逐漸減少。不同的是，無論在哪一個(gè)年齡段，癡呆小鼠腦神經(jīng)元內(nèi)的NCT免疫陽性物不僅見于細(xì)胞膜和突起，更顯著的是較多的NCT還分布于整個(gè)胞質(zhì)，即細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)均濃染;而同窩野生型小鼠腦神經(jīng)元內(nèi)的NCT主要分布于細(xì)胞膜周圍，故細(xì)胞膜周圍染色較深，而胞質(zhì)染色極淺甚至不著色。該現(xiàn)象提示，NCT在癡呆小鼠和正常小鼠腦神經(jīng)元內(nèi)的分布及表達(dá)存在差異，那么，這種差異是否與癡呆小鼠腦組織中Aβ的生成有關(guān)呢?已有研究表明，NCT最初在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，然后向高爾基復(fù)合體及細(xì)胞膜等轉(zhuǎn)運(yùn)。正常情況下，絕大多數(shù)NCT分布于高爾基體外側(cè)網(wǎng)絡(luò)(Trans-Golgi Network，TGN)，即靠近細(xì)胞膜分布;少量分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體、線粒體等位于胞漿內(nèi)或靠近核膜的細(xì)胞器〔16〕。近期研究發(fā)現(xiàn)〔7〕，NCT在亞細(xì)胞水平的分布會(huì)影響不同形式Aβ的產(chǎn)生:細(xì)胞膜富含NCT的細(xì)胞主要產(chǎn)生分泌型Aβ，其中以Aβ40為主;而若細(xì)胞的線粒體、TGN和溶酶體所含的NCT突變或表達(dá)水平增加，則導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Aβ的產(chǎn)生以Aβ42為主，成為形成SP的罪魁禍?zhǔn)?。根?jù)本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，結(jié)合相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，推測(cè)NCT在癡呆小鼠和正常小鼠腦神經(jīng)元內(nèi)分布及表達(dá)的差異與Aβ的生成及AD的發(fā)生密切相關(guān)。但NCT在兩種小鼠腦內(nèi)的分布及表達(dá)為什么會(huì)出現(xiàn)這種差異，是由于NCT在合成過程中出現(xiàn)了錯(cuò)誤折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)障礙還是NCT的蛋白降解出現(xiàn)了障礙?關(guān)于這些問題有待進(jìn)一步探討。

綜上，本實(shí)驗(yàn)通過形態(tài)學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，NCT在成年癡呆小鼠CNS各區(qū)域廣泛分布，但在大腦皮質(zhì)和海馬內(nèi)的分布最密集;NCT的分布范圍要遠(yuǎn)遠(yuǎn)比Aβ沉積的范圍廣;在不同發(fā)育階段的癡呆小鼠和同窩野生型小鼠腦內(nèi)，NCT的表達(dá)和分布出現(xiàn)了差異，這種差異可能與Aβ的生成及AD的發(fā)生有關(guān)。

1 Sheng B，Gong K，Niu Y，et al.Inhibition of gamma-secretase activity reduces Abeta production，reduces oxidative stress，increases mitochondrial activity and leads to reduced vulnerability to apoptosis:Implications for the treatment of Alzheimer's disease〔J〕.Free Radic Biol Med，2009;46(10):1362-75.

2 De Strooper B.Aph-1，Pen-2，and nicastrin with presenilin generate an active gamma-secretase complex〔J〕.Neuron，2003;38(1):9-12.

3 Herreman A，Serneels L，Annaert W，et al.Total inactivation of gammasecretase activity in presenilin-deficient embryonic stem cells〔J〕.Nat Cell Biol，2000;2(7):461-2.

4 Annaert W，De Strooper B.A cell biological perspective on Alzheimer's disease〔J〕.Ann Rev Cell Dev Biol，2002;18:25-51.

5 Yu G，Nishimura M，Arawaka S，et al.Nicastrin modulates presenilin-mediated notch/glp-1 signal transduction and betaAPP processing〔J〕.Nature，2000;407(6800):48-54.

6 Pardossi-Piquard R，Dunys J，Yu G，et al.Neprilysin activity and expression are controlled by nicastrin〔J〕.JNeurochem，2006;97(4):1052-6.

7 Morais VA，Leight S，Pijak DS，et al.Cellular localization of Nicastrin affects amyloid beta species production〔J〕.FEBS Lett，2008;582(3):427-33.

8 Hiltunen M，Mannermaa A，Thompson D，et al.Genome-wide linkage disequilibrium mapping of late-onset Alzheimer's disease in Finland〔J〕.Neurology，2001;57(9):1663-8.

9 Li R，Lindholm K，Yang LB，et al.Amyloid beta peptide load is correlated with increased beta-secretase activity in sporadic Alzheimer's disease patients〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2004;101(10):3632-7.

10 Fukumoto H，Cheung BS，Hyman BT，et al.Beta-secretase protein and activity are increased in the neocortex in Alzheimer disease〔J〕.Arch Neurol，2002;59(9):1381-9.

11 Fukumoto H，Rosene DL，Moss MB，et al.Beta-secretase activity increases with aging in human，monkey，and mouse brain〔J〕.Am J Pathol，2004;164(2):719-25.

12 Berezovska O，Ramdya P，Skoch J，et al.Amyloid precursor protein associates with a nicastrin-dependent docking site on the presenilin 1-γsecretase complex in cells demonstrated by fluoresence lifetime imaging〔J〕.J Neurosci，2003;23(11):4560-6.

13 Shah S，Lee SF，Tabuchi K，et al.Nicastrin functions as a gamma-secretase-substrate receptor〔J〕.Cell，2005;122(3):435-47.

14 Hebert SS，Serneels L，Dejaegere T，et al.Coordinated and widespread expression of gamma-secretase in vivo:evidence for size and molecular heterogeneity〔J〕.Neurobiol Dis，2004;17(2):260-72.

15 Kodam A，Vetrivel KS，Thinakaran G，et al.Cellular distribution of gamma-secretase subunit nicastrin in the developing and adult rat brains〔J〕.Neurobiol Aging，2008;29(5):724-38.

16 Confaloni A，Crestini A，Albani D，et al.Rat nicastrin gene:cDNA isolation，mRNA variants and expression pattern analysis〔J〕.Brain Res Mol Brain Res，2005;136(1-2):12-22.