飲酒和CYP1A1-MspI、ALDH-2基因多態(tài)性與食管癌的相關性

張超賢 郭李柯 郭曉鳳

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院消化內科，河南 衛(wèi)輝 453100)

食管癌的發(fā)病同多數惡性腫瘤一樣，是環(huán)境因素與遺傳因素共同作用的結果，迄今為止，其確切病因尚不清楚。外來化合物一般不能直接起致癌作用，需經一系列酶系統(tǒng)代謝活化或轉化而成為終致癌物后起作用，有的經轉化后毒性降低易于排出體外。編碼這些酶的某一些基因具有多態(tài)性，即具有多個等位基因，不同的等位基因編碼的酶活性有差異。代謝酶基因的多態(tài)性可使機體清除外源性致癌物的能力有所不同，導致基因的穩(wěn)定性和細胞的癌變率有所改變，這是決定機體腫瘤易感性的一個重要因素。代謝酶基因多態(tài)性與食管癌易感性的研究日漸增多，目前發(fā)現的與食管癌易感性相關的代謝酶有細胞色素P450(CYP450)、谷胱甘肽轉硫酶(GSTs)、乙醛脫氫酶(ALDH)、亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)等〔1～4〕。為了研究CYP1A1 MspI和ALDH-2在當地人群中的分布狀態(tài)，進而探索其和飲酒習慣相互作用與食管癌高發(fā)的關系，本研究在國內首次開展了CYP1A1 MspI和ALDH-2聯合基因多態(tài)性與食管癌易感性關系的研究。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2005年3月～2007年4月在我院收治的食管癌患者160例，年齡(54.38±6.92)歲，病理學確診均為原發(fā)性食管鱗癌或腺癌。對照組160例為健康體檢人群，年齡(53.85±3.42)歲，體檢顯示無腫瘤及遺傳性疾病，兩組在年齡、性別、民族、籍貫統(tǒng)計學處理差異無顯著性，無血緣關系，調查收集研究對象的人口學資料、吸煙史、職業(yè)史和家族腫瘤史。飲酒狀況由飲酒指數(DI)來估計，DI表示每日飲酒兩數×飲酒年數，本文分為不飲酒、DI≤60者和DI＞60者。每人各抽取靜脈血2～3 ml，置EDTA抗凝管，分離白細胞層。用QIAamp-DNA提取試劑盒(德國QIAgen公司)提取白細胞DNA，DNA置－30℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩山M臨床資料見表1。

1.2 基因測定

1.2.1 CYP1A1 MspI多態(tài)性分析 引物序列5-CAG TGA AGA GGTGTA GCCGCT-3和5-TAG GAG TCT TGT CTCATGCCT-3，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR反應體系總量 25μl，包括 10×緩沖液 2.5μl、1 mmol/L dNTP 2.5 μl、引物各15 pmol、TaqDNA 聚合酶2.5 U、模板 DNA 2 μl，以上試劑購自美國 Promega公司。擴增參數:94℃預變性4 min，94℃變性 40 s，55℃退火 40 s，72℃延伸 50 s，于美國 PE公司PE480 PCR儀中循環(huán)35次后，72℃延伸7 min。取PCR擴增產物5μl于1.5%瓊脂糖凝膠中，100 V電泳1 h，EB染色30 min，紫外分析儀觀察PCR擴增結果。電泳板瓊脂糖由大連寶生物工程有限公司生產。取PCR產物10μl，加入MspI內切酶(大連寶生物公司)，酶切反應體系總量30μl，包括PCR產物 10 μl、10 × 反應緩沖液2 μl、MspI內切酶10 U，37℃ 3 h。酶切后產物點樣于1.5%瓊脂糖凝膠中，100 V電泳1 h，EB染色30 min，分析結果。酶切后分為3種基因型:野生型A(m1/m1)為 340 bp，雜合型 B(m1/m2)為 340、200、140 bp，突變純合型 C(m2/m2)為 200、140 bp。見圖 1。

1.2.2 ALDH-2多態(tài)性分析 采用PCR-RFLP引物序列〔2〕:Y3∶5'-CCCTTTGGTGGCTAGAAGATG-3'，Y4∶5-CCACACTCACAGTTTTCTCTT-3'。擴增片段為 91 bp。PCR擴增體系為25 μl，內含 1 μl DNA，1 μmol/L 引物，0.25 mmol/L4 × dNTP，0.25 mmol/L MgCl2，1 UTaq酶(購自寶生生物工程有限公司)，以及2.5μl 10×緩沖液。擴增條件為:95℃預變性10 min，然后進行 35 個循環(huán)(95℃ 1 min，58℃ 2 min，72℃1 min)，最后72℃延伸5 min。擴增后取PCR產物3μl，加入5UMboⅡ限制性內切酶(購自寶生生物工程有限公司)及與內切酶相配套使用的10×緩沖液，總量為10μl，37℃消化2.5 h。酶切產物的電泳分離與結果判斷。取酶切產物8μl，作15%聚丙烯酰胺凝膠電泳，EB染色，紫外燈照射，觀察結果。谷氨酸純合型ALDH12(G/G)-55 bp;谷氨酸賴氨酸雜合型 ALDH1＊22(G/L)-65 bp，55 bp;賴氨酸純合型ALDH22(L/L)-65 bp。見圖2。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包進行χ2檢驗和Logistic回歸分析。

2 結果

2.1 CYP1A1 MspI、ALDH-2基因型分布情況及兩者與食管癌易感性的協(xié)同分析 食管癌組與對照組CYP1A1 MspI(m2/m2)差異有顯著(P＜0.01)，食管癌組與對照組ALDH2(Non-G/G)差異亦有顯著性(P＜0.01);兩者協(xié)同分析顯示，CYP1A1 MspI(m2/m2)/ALDH2(Non-G/G)在食管癌組占31.875%，而對照組僅占6.250%，基因組合CYP1A1 MspI(m2/m2)/ALDH-2(Non-G/G)的食管癌患病比例是CYP1A1 Msp(Non-m2/m2)/ALDH-2(G/G)的9.909倍，兩個基因型之間存在協(xié)同作用。見表 2，表 3。

2.2 食管癌的易感性與飲酒的相關分析 將正常對照組的飲酒人數和不飲酒人數與食管癌組的飲酒人數和不飲酒人數進行χ2檢驗，結果表明食管癌的發(fā)生與飲酒有關，飲酒者容易患食管癌(OR=3.096，95%CI=1.532 ～4.880，P ＜0.01);食管癌易感性與飲酒指數相關分析顯示，高飲酒組較低飲酒組更易患食管癌(OR=6.131，95%CI=3.964～8.315，P ＜0.01)。見表 4，表 5。

2.3 CYP1A1 MspI和ALDH-2基因型和飲酒與食管癌易感性的協(xié)同分析 食管癌組中攜帶CYP1A1 MspI(m2/m2)/ALDH-2(Non-G/G)和飲酒者明顯較對照組多，CYP1A1 MspI(m2/m2)/ALDH-2(Non-G/G)吸煙者占食管癌組的30.000%，而在對照組中僅1.875%，有顯著性差異(P＜0.01);飲酒指數與CYP1A1 MspI/ALDH-2和食管癌易感性的協(xié)同分析顯示，CYP1A1 MspI(m2/m2)/ALDH-2(Non-G/G)/DI＞60組合的患病比例是CYP1A1 Msp(Non-m2/m2)/ALDH2(G/G)/SI≤60組合的352.500倍。見表6，表7。

表1 食管癌組和對照組的一般資料〔n(%)，n=160〕

表2 兩組CYP1A1 MspI、ALDH-2基因型多態(tài)性分布〔n(%)，n=160〕

表3 CYP1A1 Msp I和ALDH-2基因型與食管癌易感性的協(xié)同分析〔n(%)〕

表4 食管癌易感性與飲酒的相關性分析〔n(%)，n=160〕

表5 食管癌易感性與DI相關分析〔n(%)，n=160〕

表6 CYP2E1-RsaI/ALDH 2基因型和飲酒與食管癌易感性的協(xié)同分析〔n(%)，n=160〕

圖1 CYP1A1 PCR產物MspI酶切電泳

圖2 ALDH-2基因PCR產物檢測

表7 CYP2E1-RsaI/ALDH-2基因型和DI與食管癌易感性的協(xié)同分析〔n(%)，n=160〕

3 討論

酒精不是一種致癌劑，而酒精的代謝產物——乙醛卻具有明顯的致癌作用。研究發(fā)現，乙醛是一種肯定性的致癌劑，它與人類腫瘤的發(fā)生存在著一定的關系〔5〕。乙醛脫氫酶(ALDs)是人體內代謝酒精的酶。ALDH-2是由ALDH-2基因編碼，該基因在染色體上的位置為:12q24，由13個外顯子構成，編碼的酶蛋白肽鏈由500個氨基酸殘基組成。ALDH-2基因有二個等位基因，把具有催化活性的野生型稱為:ALDH12，催化能力失活的變異型稱為:ALDH22。由于遺傳，在人群中該酶基因型出現3種情況，具有正常催化活性純合子型。ALDH1＊12(G/G);催化活性下降的雜合子型:ALDH1＊22(G/L);催化活性失去的純合子型ALDH2＊22(L/L)。后兩種基因型可引起相應的ALDH-2表達缺失或活性降低，導致機體乙醛的集聚，從而增加特定腫瘤發(fā)病率，國內外研究證明ALDH-2基因多態(tài)性與多種腫瘤風險相關〔5，6〕。

大多數環(huán)境致癌物在體內都需要代謝激活后才有致癌性，乙醛同樣需要經過體內I相代謝酶的活化，CYP1A1是重要的I相代謝酶之一，CYP1A1可催化乙醛等外來化合物進人體內的I相氧化反應，把無活性的前致癌物激活轉變?yōu)橛H電子化合物，該親電子化合物可攻擊細胞內的生物大分子，與DNA或蛋白質形成加合物，最終引起癌基因和抑癌基因的改變，從而導致癌變。CYP1A1基因定位于人類染色體15q 22224，包含7個外顯子和6個內含子。CYP1A1的表達受基因的控制和環(huán)境因素的誘導其本底表達和誘導表達水平均有顯著的個體差異。其3'端非翻譯區(qū)的 T6235C置換產生一個 MspⅠ酶切位點即MspⅠ多態(tài)性，突變基因的存在可能是通過與該基因調節(jié)區(qū)其他多態(tài)性的連鎖而影響CYP1A 1的誘導性。已有研究報道認為Msp I位點的多態(tài)性與喉癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌等腫瘤的易感性有關〔7，8〕。本研究與上述研究結果一致。CYP1A 1(m2/m2)基因型者易患食管癌的機制還不清楚，相關研究均明m2基因型的酶活性高于m1基因型。因此，m2/m2純合子易患食管癌的原因可能是此種基因型者體內CYP1A 1活性高，可產生更多的活性致癌物〔9〕。

本研究發(fā)現ALDH-2(Non-G/G)與食管癌的發(fā)生有關，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，ALDH-2(Non-G/G)與CYP1A 1(m2/m2)對食管癌的發(fā)生有顯著的協(xié)同作用，兼有ALDH-2(Non-G/G)與CYP1A 1(m2/m2)型者食管癌發(fā)生率是兼有ALDH-2(G/G)和CYP1A 1(Non-m2/m2)型食管癌發(fā)生率的9.909倍。此外，本研究發(fā)現飲酒與食管癌的易感性有關(OR=3.096，95%CI=1.532～4.880，P ＜0.01)。對 CYP1A 1-MspI和ALDH-2基因型與飲酒關系的協(xié)同分析發(fā)現，在食管癌患者中攜帶CYP1A 1(m2/m2)型基因且飲酒、ALDH-2(Non-G/G)基因型人較對照組多，經統(tǒng)計學檢驗差異有顯著性(P＜0.01)。CYP1A 1(m2/m2)/ALDH-2(Non-G/G)型飲酒者發(fā)生食管癌的危險顯著增加(OR=40.727，95%CI=17.965～66.572)，通過對吸煙狀況分析，發(fā)現大量飲酒者(DI＞60)且具有ALDH-2(Non-G/G)與CYP1A 1(m2/m2)基因型者患食管癌的相對危險度大(OR=352.500，95%CI=229.833～463.317)，對于DI≤60者，ALDH-2(Non-G/G)/CYP1A 1(m2/m2)基因型者患食管癌的風險(OR值)為3.750，可以看出，飲酒量越大，時間越長，食管癌患病風險越大。

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