多浪羊IFN－γ基因克隆及核苷酸序列分析

左文斌 潘 輝 李蓮瑞

干擾素(IFN－γ)是具有正常生理功能的細(xì)胞在適宜的誘生劑的作用下產(chǎn)生的能夠抑制病毒增殖的一類重要細(xì)胞因子，其化學(xué)本質(zhì)是一種糖蛋白，具有廣譜抗病毒、抗細(xì)胞分裂增殖及免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能［1］。干擾素具有抑制細(xì)胞增生、免疫調(diào)節(jié)及抗炎癥活性，因而對(duì)宿主防御機(jī)制很重要。

隨著病原菌新毒株、變異株的不斷出現(xiàn)，我國(guó)動(dòng)物疾病的防治面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。自發(fā)現(xiàn)干擾素以來，干擾素已經(jīng)顯示出極強(qiáng)的抗病毒、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)活性和應(yīng)用前景，干擾素的研究越來越受到人們的廣泛關(guān)注［2］。目前干擾素在基礎(chǔ)理論和實(shí)踐應(yīng)用上仍需要進(jìn)行大量的研究，通過對(duì)多浪羊IFN－γ基因的克隆與序列分析，能夠?yàn)槎嗬搜騃FN－γ的功能研究和免疫應(yīng)答相關(guān)基因的篩選奠定基礎(chǔ)，為IFN－γ基因工程藥物的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

多浪羊由塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院提供;DH5α感受態(tài)細(xì)胞本實(shí)驗(yàn)室制作保存;Trizol Reagent購(gòu)自Invitrogen公司;RT－PCR試劑盒、pMD18－T載體、DL2000 DNA Marker、限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I購(gòu)自大連寶生物工程有限公司;DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司;其它試劑由本實(shí)驗(yàn)室配制。

1.2 方法

1.2.1 總 RNA 提取

無菌采集多浪羊羊外周血20 mL，加入3.8%枸櫞酸鈉抗凝。然后參照賀艷艷［3］等分離淋巴細(xì)胞的方法，分離淋巴細(xì)胞。按Invitrogen Trizol試劑說明書提取總RNA，置于－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù) GenBank上的 IFN－γ基因序列 NM_001009803設(shè)計(jì)引物:

上游引物為 5’－GGCCTCGAGAGGCAGGAGAACCATTAC －3’，

下游引物為5’－GGCGAATTCCACAGGAGCTACCGATTT －3’。

1.2.3 兩步法擴(kuò)增IFN－γ基因

采用使用Invitrogen公司的SuperScript cDNA First－strand Synthesis System進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)產(chǎn)物保存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

PCR反應(yīng)體系:10×one step RT－PCR buffer 2 μL，dNTP1.6 μL，Taq DNA 聚合酶 0.4 μL，PF(20 pmol/ μL)0.5 μL，PR(20 pmol/ μL)0.5 μL，模板 cDNA 0.5 μL，ddH2O 14.5 uL

PCR反應(yīng)條件:95℃ 5 min;然后94℃ 1 min，55℃ 30 s，72℃ 40 s 35個(gè)循環(huán);72℃ 10 min，4℃保存。

1.2.4 瓊脂糖凝膠電泳鑒定RT－PCR結(jié)果

采用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)RT－PCR結(jié)果。

1.2.5 IFN －γ 基因的克隆及鑒定

用切膠回收試劑盒回收目的基因后與pMD18－T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有氨芐青霉素的平板，37℃過夜培養(yǎng)。挑取單菌落在LB液體培養(yǎng)液中培養(yǎng)，進(jìn)行菌液PCR和酶切鑒定。

1.2.6 IFN－γ基因測(cè)序及序列分析

挑選陽性克隆送北京華大中生科技發(fā)展有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用DNAman等軟件進(jìn)行序列分析。

2 結(jié)果

2.1 IFN－γ基因RT－PCR結(jié)果

RT－PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳，與DNA Marker DL 2000比較，目的條帶出582 bp與預(yù)期相吻合(見圖1)。

圖1 IFN－γ－PCR結(jié)果

2.2 IFN－γ－pMD－18T重組質(zhì)粒結(jié)果鑒定

挑取LB瓊脂平板上的白色菌落，通過菌液PCR鑒定，菌液PCR結(jié)果見圖2，然后對(duì)鑒定為陽性的菌液提取質(zhì)粒DNA，用EcoR I和Xho I進(jìn)行雙

圖2 IFN－γ－pMD－18T重組質(zhì)粒菌液PCR結(jié)果

2.3 IFN－γ基因序列分析

(1)測(cè)序后的多浪羊IFN－γ基因的核苷酸序列

圖3 IFN－γ－pMD－18T重組質(zhì)粒雙酶切結(jié)果

測(cè)序結(jié)果全長(zhǎng)為582bp(見圖4)，將測(cè)得的核酶切鑒定(圖3)，圖3結(jié)果出現(xiàn)兩條明顯條帶:2692 bp處為pMD－18T質(zhì)粒、574 bp處為酶切后的目的基因。苷酸序列用Expasy tools分析，將核酸序列和氨基酸序列相對(duì)應(yīng)(見圖4)。由圖5可以看出多浪羊IFN－γ的完整開放閱讀框的核苷酸序列長(zhǎng)度為501bp，成熟蛋白編碼的氨基酸序列長(zhǎng)度為166個(gè)氨基酸。

圖4 多浪羊IFN－γ基因全序列

(2)IFN－γ核苷酸多序列比對(duì)結(jié)果

通過比對(duì)發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增的目的片段在第391位一個(gè)相對(duì)保守的堿基處出現(xiàn)了一個(gè)突變，由A突變成了G，而在此位置上參比的序列都是A，可能A是高度保守的(圖5)。

圖5 IFN－γ核苷酸多序列比對(duì)

(3)IFN－γ氨基酸多序列比對(duì)結(jié)果

根據(jù)氨基酸多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)第131位由一個(gè)賴氨酸(AAA)變成了一個(gè)谷氨酸(GAA)(見圖6)。

圖6 IFN－γ氨基酸多序列比對(duì)

3 討論

隨著人們對(duì)干擾素研究的不斷深入，尤其是在分子生物學(xué)方面的研究，干擾素的分子結(jié)構(gòu)、理化特性、生物學(xué)特性 、產(chǎn)生和作用 機(jī)理不斷得到闡明。在未來的臨床研究中，IFN將會(huì)推進(jìn)我們對(duì)免疫調(diào)節(jié)過敏，哮喘，自身免疫性疾病，腫瘤的發(fā)展，器官移植，慢性感染機(jī)制的了解，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)有效和有針對(duì)性的治療疾病的方法［4］。鑒于IFN－γ強(qiáng)大的生物學(xué)功能，其相關(guān)基礎(chǔ)和應(yīng)用研究日漸增多，一些干擾素制品也逐漸出現(xiàn)和進(jìn)入臨床應(yīng)用［5］。由于體外細(xì)胞刺激時(shí)干擾素的表達(dá)量很低且難以純化，難以獲得足夠量的蛋白用于試驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用，因而采用基因工程手段制備干擾素顯得尤為重要。

近年來，隨著對(duì)細(xì)胞因子研究的不斷深入和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，在國(guó)內(nèi)多種動(dòng)物的IFN－γ基因［6－9］相繼被克隆，其相應(yīng)的生物制劑在臨床上也得到了顯著的效果。

本研究應(yīng)用RT－PCR技術(shù)成功克隆的多浪羊IFN－γ基因片段大小在582 bp左右。將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析得出多浪羊IFN－γ的核苷酸序列長(zhǎng)度和氨基酸序列長(zhǎng)度，通過NCBI BLASTp進(jìn)行分析對(duì)多物種IFN－γ核苷酸和氨基酸多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)測(cè)得目的基因的核苷酸在391位發(fā)生了突變，導(dǎo)致氨基酸序列的第131位氨基酸由賴氨酸突變?yōu)楣劝彼?。賴氨酸為堿性氨基酸而谷氨酸為酸性氨基酸，編碼的多肽鏈第131位的氨基酸由堿性氨基酸突變?yōu)樗嵝园被?，其氨基酸的性質(zhì)變化較大，這可能是多浪羊適應(yīng)新疆當(dāng)?shù)丨h(huán)境的一種選擇性突變，需要進(jìn)行更進(jìn)一步的研究是非常有必要的，對(duì)于研究動(dòng)物的分子進(jìn)化及其在動(dòng)物分類上應(yīng)用可能具有一定的意義。

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