南疆不同品種綿羊MSTN基因克隆及其組織表達譜分析

尹闊 任述強 徐國江 李樹偉* 劉勝梅

在 1807 年，CulleyG［1］在《Observations on livestock》上描述了肌生成抑制素(Myostatin，MSTN)基因缺失所致的雙肌表型(double－muscling)的牛。1997年，McPherron AC等［2］在研究轉(zhuǎn)化生長因子(Transforming growth factor－β，TGF－β)超家族時，發(fā)現(xiàn)了生長/分化因子－8(Growth/Differentiation fator，GDF－8)，之后將其命名為肌生成抑制素。MSTN是一種分泌型多肽，由前體蛋白質(zhì)、信號肽編碼前肽的N－端區(qū)和編碼成熟肽C－端區(qū)三部分組成，能夠?qū)∪馍L起負調(diào)控作用。MSTN基因結(jié)構(gòu)和功能的揭示使得畜禽業(yè)和醫(yī)學研究有了新的發(fā)展。Thomas M等［3］對小型豬研究表明，小型豬與其它肌肉量大的豬相比，其MSTN表達量高。李樹偉等［4］將豬肌生成抑制素成熟蛋白編碼序列在真核細胞中表達成功。A lexandra C等［5］通過分析肥胖小鼠中的肌肉生長抑制素基因突變對脂肪積累的影響，發(fā)現(xiàn)它的脂肪聚積可被抑制70%。在含有肌肉生長抑制素突變的刺鼠中，異常的葡萄糖代謝也被部分抑制。在對小鼠和大鼠的研究中表明［6～8］，MSTN 基因在小鼠胚胎肌細胞中的作用主要是調(diào)節(jié)了增殖和分化的平衡;在小鼠乳腺上皮細胞中的表達，其主要是和上皮細胞作用，并且與乳腺的分化成負相關(guān);對無負重肌肉萎縮大鼠經(jīng)10天跑臺訓練后研究顯示，MSTN mRNA表達和蛋白水平明顯降低，與運動促進骨骼肌的再生密切相關(guān)。由此可見，MSTN基因在動物的生長和調(diào)控中起著重要作用，因此在豬、牛、羊、雞、鴨等畜禽品種中把MSTN基因作為生產(chǎn)性狀的重要基因進行研究。

和田羊、卡拉庫爾羊是新疆南疆重要的綿羊品種之一，其羊毛制品、羔皮制品和羊肉為新疆南疆經(jīng)濟增長和人們生活水平提高有著重要作用。目前和田羊、卡拉庫爾羊在飼料營養(yǎng)、雜交、生化指標［9］和遺傳方面做過相關(guān)報道，而在MSTN基因克隆和表達譜分析方面還尚未見報道。本實驗通過RTPCR技術(shù)對MSTN基因表達譜進行研究，并為今后的進一步研究奠定基礎(chǔ)，以期在畜牧業(yè)上有很好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

試驗樣本采自和田羊山區(qū)型、和田羊平原型和卡拉庫爾羊的心臟、肝臟、腎臟、肺臟、脾臟、腿肌肉組織，各品種綿羊分別由和田地區(qū)策勒縣、洛浦縣和塔里木大學動科院實驗站提供。采集后迅速置于液氮中保存。

1.1.2 儀器與試劑

PCR儀(美國BIO－RAD);電泳儀(美國BIORAD);凝膠成像分析儀(美國BIO－RAD);IKA分散機 T18 basic(德國IKA);BioPhotometer(德國eppendorf);低溫高速冷凍離心機(德國SIGMA);Trizol購自 Invitrogen公司;TAKARA Reverse Tran-SCriptase M－MLv(RNaseH－)和分子量標準DL－2，000均購自大連TaKaRa公司;引物合成在上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 綿羊各組織總RNA提取

用Trizol法提取和田羊和卡拉庫爾羊組織樣總RNA，具體操作參照試劑盒說明書進行。提取的總RNA用無RNase dH2O溶解，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。用BioPhotometer對所抽提總RNA樣品進行吸光度檢測，樣品檢測值A(chǔ)260/280均在1.8±0.1之間。提取的樣品于－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 MSTN 基因引物設(shè)計

參照GenBank中已發(fā)表的綿羊MSTN基因cDNA 序列(GenBank登錄號:NM_001009428.1)，結(jié)合Primer5.0的設(shè)計和 Oligo6.0評價，設(shè)計 cDNA引物，為避免非特異性擴增，將引物的退火溫度設(shè)計的稍高(66℃)，以β－actin作為內(nèi)參，將模板濃度調(diào)整一致。上游引物序列為006F:CCA TGG ATG GAT TTT GGG CTT GAT TGT GAT GAG，下游引物序列為006R:CTC GAG TTA TCA TGA GCA CCC ACA GCG ATC TAC TAC

1.2.3 總RNA的反轉(zhuǎn)錄

取總RNA 1μL，加 Oligo(dT)12－18 Primer 1μL，無RNase dH2O 到6μL，70℃保溫10 min后迅速在冰上急冷2 min以上，離心數(shù)秒使模板RNA的變性溶液聚集于離心管底部，加5×M－MLV Buffer 2 μL，dNTPs(各10 mM)0.5 μl，RNase inhibitor(40 U/μl)0.25 μl，RTaseM － MLV(RNase H － )(200 U/μl)0.5 μl，補無 RNase dH2O 至 10 μl，混勻，42℃保溫1 h，70℃保溫15 min后冰上冷卻。PCR 反應(yīng):10 × PCR buffer 2.5 μl，dNTP 0.5 μl，MgCl23 μl，Taq 酶 0.1 μl，006F 0.5 μl，006R 0.5 μl，cDNA 2μl。循環(huán)程序為:94 ℃預(yù)變性11 min;94 ℃變性30 s，66 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán);72℃延伸10 min。

2 結(jié)果

2.1 綿羊各組織中總RNA提取

如圖1所示，用 Trizol法提取綿羊各組織總RNA，運用1%的瓊脂糖凝膠電泳對總RNA進行檢測。

2.2 PCR 擴增

2.2.1 卡拉庫爾羊PCR結(jié)果

利用006引物和β－actin對卡拉庫爾羊心臟、肝臟、腎臟、肺臟、脾臟、肌肉進行PCR擴增，于2%瓊脂糖凝膠中的電泳結(jié)果如圖2(A)和(B)，結(jié)果顯示，在肝臟、腎臟、脾臟、肌肉中有MSTN C端110個氨基酸編碼序列的PCR擴增產(chǎn)物，擴增產(chǎn)物長度約370 bp。其他組織中未見表達。

2.2.2 和田羊平原型PCR結(jié)果

利用006引物和β－actin對和田羊平原型心臟、肝臟、腎臟、肺臟、脾臟、肌肉進行PCR擴增，于2%瓊脂糖凝膠中的電泳結(jié)果如圖3(C)和(D)，結(jié)果顯示，在心臟、腎臟、脾臟、肌肉中有MSTN C端110個氨基酸編碼序列的PCR擴增產(chǎn)物，擴增產(chǎn)物長度約370 bp。在其他組織中未見表達。

2.2.3 和田羊山區(qū)型PCR結(jié)果

利用006引物和β－actin對和田羊(山區(qū)型)心臟、肝臟、腎臟、肺臟、脾臟、肌肉進行PCR擴增，產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中的電泳結(jié)果如圖4(E)和4(F)，結(jié)果顯示，在心臟、腎臟、脾臟、肌肉中有MSTN C端110個氨基酸編碼序列的PCR擴增產(chǎn)物，擴增產(chǎn)物長度約370 bp。在其他組織中未見表達。

3 討論

從1997年McPherron AC等［1］發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子(Transforming growth factor－β，TGF－β)超家族新成員——生長/分化因子 －8(Growth/Differentiation fator，GDF－8)后，國內(nèi)外研究人員又對大鼠、豬、人、火雞、雞、狒狒、綿羊、山羊、牛、馬、斑馬魚等動物的MSTN基因進行了結(jié)構(gòu)、功能、表達機制、生理作用等方面的研究，發(fā)現(xiàn)并非是動物的所有組織中都能表達肌肉生成抑制素，而且在骨骼肌中表達量也隨時間不同而有變化。

本研究根據(jù)GenBank上登錄的綿羊的MSTN基因序列，設(shè)計引物，成功克隆了綿羊的MSTN C端110氨基酸編碼序列。研究顯示，MSTN基因在綿羊的肌肉中均有表達與文獻報道的結(jié)果一致。在山區(qū)型、平原型和田羊的肝臟中無表達，而在卡拉庫爾羊的肝臟中有表達。歐陽紅生［10］、［11］研究小組擴增了大約克夏豬MSTN基因的全部序列6015bp，包括兩個內(nèi)含子和三個外顯子，克隆了MSTN基因的cDNA測出了MSTN基因的編碼序列，并采用了RTPCR擴增法研究了MSTN基因在豬骨骼肌、心肌、肝、腎、肺、脾、胰、脂肪組織中的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSTN基因僅在骨骼肌、心肌組織中表達。Ji S等［12］測定了生長發(fā)育期豬的各組織后發(fā)現(xiàn)MSTN mRNA基因主要分布于骨骼肌中，在其他組織如:脂肪組織、腦、舌、心、肺、脾、小腸、腎、肝和骨髓也有少量的分布，而且該研究還表明MSTN在乳腺中也有表達。Kubota K等［13］在雞胚的腦、眼、胃、骨骼肌、心臟、小腸、大腸、腎、睪丸、卵巢中均檢測到MSTN基因的表達，但是肝臟中沒有表達。MSTN在不同物種間表達各不相同，可以推測MSTN在機體中的作用是多方面的。

Sharma等［14］發(fā)現(xiàn)在羊和牛心臟的浦肯野氏纖維和心肌細胞中也有MSTN基因mRNA的表達，實驗表明，當心肌梗塞時，在受損部位周圍的心肌細胞肌抑素表達上調(diào)，推測肌抑素在心肌發(fā)育和生理過程中期起重要作用。Rodgers等［15］分離了羅非魚(Oreochromis mossambicus)和白狼鱸(Morone chrysops)的骨骼肌MSTN cDNA序列。結(jié)果表明:MSTN在羅非魚中的表達不僅僅局限于骨骼肌，在多種組織如眼、鰓絲、腸、大腦、性腺中都有表達。而且，羅非魚幼苗MSTN表達的時序性與肌形成一致。這些結(jié)果表明，在羅非魚中(其他魚類也有可能)，MSTN的生理作用不僅僅局限于抑制肌細胞的生長，還有可能影響細胞類型和器官系統(tǒng)的分化。Kim等［16］研究了MSTN在3T3－L1脂肪前體細胞的分化中的作用。他們的數(shù)據(jù)表明，在3T3－L1細胞中MSTN抑制脂肪前體細胞的分化，它被介導(dǎo)或部分被C/EBPα和PPARγ輪流調(diào)控。說明MSTN在脂肪細胞發(fā)育中也有作用。而本研究中MSTN基因在和田羊和卡拉庫爾羊在心肌、肺臟、腎臟、脾臟中各有異同，說明MSTN基因除了在骨骼肌中抑制肌肉的生成外，在機體中還可能參與脂類代謝、糖代謝、呼吸、泌尿、免疫以及細胞類型和器官系統(tǒng)分化，Steven L等［17］曾專門以“Gatekeepers of organ growth”為題發(fā)表評論，說明MSTN在器官生長中的作用。

綜上所述，MSTN基因除抑制骨骼肌生成外，對維持機體正常的生理平衡有重要作用.找到一種能夠可調(diào)控地阻斷MSTN蛋白功能，又不影響機體其它生理功能的技術(shù)手段成為MSTN基因在畜牧業(yè)應(yīng)用上所面臨的問題。

4 結(jié)論

山區(qū)型和田羊、平原型和田羊、卡拉庫爾羊的MSTN基因在肌肉、腎臟、脾臟中都有表達，與文獻報道一致。可見MSTN除了在骨骼肌中的作用外，還可初步推測MSTN基因在器官組織中有一定作用。山區(qū)型、平原型和田羊MSTN基因在心肌中有一定表達，而在卡拉庫爾羊在心肌中幾乎無表達，還需要進一步的研究分析是物種原因還是MSTN表達時序性所致。MSTN在山區(qū)型、平原型和田羊的肝臟中幾乎無表達，而在卡拉庫爾羊中則有一定量表達。MSTN在山區(qū)型和田羊、平原型和田羊與卡拉庫爾羊的肺臟中則都無表達。根據(jù)實驗和文獻資料分析，對MSTN基因在各組織中進行更深入的研究，將揭示MSTN基因更多生理功能。

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