孟慶澤,喬保平,宮璀璀,劉德海,張喜卿
1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科鄭州450052 2)中國人民解放軍153中心醫(yī)院泌尿外科鄭州450042 3)中國人民解放軍153中心醫(yī)院中心實驗室鄭州450042 4)中國人民解放軍153中心醫(yī)院病理科鄭州450042
腎癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,轉移是惡性腫瘤治療失敗和患者死亡的主要原因,盡管近年來各種治療方法不斷改進和完善,但轉移性腎癌患者的預后仍然較差。因此,仍需進一步尋找和開發(fā)新的用于治療腎癌的方法和分子靶點。Tiam1(T lymphoma invasion and metastasis inducing factor 1)是近年來發(fā)現的一種原癌基因,研究[1]發(fā)現Tiam1通過Tiam1-Ras信號通路調控腫瘤細胞的侵襲和轉移,該通路的異常與多種惡性腫瘤密切相關。索坦能抑制多個受體酪氨酸激酶,降低血小板源生長因子受體、血管內皮細胞生長因子、干細胞因子受體等活性,進而抑制腫瘤生長,阻止病理性血管形成和腫瘤轉移[2]。作者應用不同濃度的索坦干擾腎透明細胞癌株786-0,采用MTT和TUNEL法檢測各組腎癌細胞凋亡和存活情況,采用免疫細胞化學和原位雜交技術檢測各組腎癌細胞中Tiam1蛋白和mRNA表達情況,探討索坦對腎透明細胞癌細胞Tiam1生長和表達的影響。
1.1 主要試劑和細胞 索坦購自美國輝瑞公司;Trizol試劑購自Invitrogen公司;DNAaseⅠ購自上海生工生物工程有限公司;5-溴4-氯3-吲哚磷酸/硝基藍四唑鹽(BCIP/NBT)購自Promega公司;鼠抗人Tiam1單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司;即用型免疫組化廣譜試劑盒和DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術有限公司。腎透明細胞癌細胞786-0為鄭州大學醫(yī)學院重點實驗室保存。
1.2 細胞培養(yǎng)與分組 應用含體積分數10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞,置于36.5℃、體積分數5%CO2培養(yǎng)箱內,取生長狀態(tài)良好的細胞用于實驗。每孔2×107個細胞接種于96孔板中,每組設3個復孔,將處于對數生長期的786-0細胞分成4組:索坦低濃度處理(A)組、索坦中濃度處理(B)組、索坦高濃度處理(C)組、正常對照(D)組。細胞鋪板后24 h,A、B和C組分別加入索坦2、4和8 μmol/L,D組加常規(guī)DMEM培養(yǎng)液,分別培養(yǎng)24、48、72 h。
1.3 Tiam1蛋白的檢測 采用免疫細胞化學方法。40 g/L多聚甲醛固定的細胞標本經體積分數0.3%TritionX-100/PBS透化后,加正常羊血清封閉,Tiam1一抗按照1∶100稀釋,4℃溫度孵育過夜。PBS洗后,置37℃孵育1.5 h,DAB顯色,伊紅復染。陰性對照實驗用PBS代替一抗。Tiam1蛋白陽性染色表現為黃色或棕色顆粒,以細胞質中表達為主。①染色強度:無色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,黃褐色為3分。②染色范圍:隨機選擇5個高倍視野(×400),陽性細胞百分比≤10%為0分,~25%為1分,~50%為2分,>50%為3分。①×②為最后得分[3]。
1.4 Tiam1 mRNA的檢測 采用原位雜交法。待細胞生長狀態(tài)良好、鋪滿瓶壁后,用冰預冷的PBS洗2遍,參照說明書,用Trizol試劑常規(guī)提取細胞總RNA,總RNA用DNaseⅠ消化去除殘存的基因組DNA。PBS液取代一抗作陰性對照。結果判定:Tiam1 mRNA原位雜交陽性信號呈藍紫色,位于胞質內。光鏡下每張隨機選取10個高倍視野,按陽性細胞數所占百分比及著色深淺進行結果判定[4]。①按陽性細胞百分比計分:<1%為0分,1% ~為1分,26% ~為2分,51% ~為3分,≥76%為4分。②按著色深淺計分:無著色為0分,淡藍色為1分,藍色為2分,藍紫色為3分。①×②為最后得分。
1.5 細胞存活率的檢測 各組細胞培養(yǎng)48 h后,MTT法測細胞存活率,每組3個復孔。每孔加20 μL MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去上清液,加DMSO 200 μL/孔,振蕩,充分溶解。在酶標儀490 nm波長處讀取吸光度(A)值。細胞存活率=實驗組A值/對照組A值×100%。
1.6 細胞凋亡率的檢測 采用TUNEL法。取各組培養(yǎng)48 h細胞,用40 g/L多聚甲醛固定制備的滴片,5 μg/L蛋白酶K 37℃消化10 min。每片加末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)緩沖液18 μL,Bio-Dutp及TdT各1 μL,4℃過夜。加親和素-堿性磷酸酶(SAALP)37 ℃,20 min孵育后,Tris-HCl pH 7.5洗3次,pH 9.5洗2次,BCIP/NBT底物顯色,熒光復染。陰性對照用TdT緩沖液代替TdT。顯微鏡下觀察,凋亡細胞核和(或)細胞質呈棕褐色,細胞核無著色為陰性。凋亡指數(apoptosis index,AI)的計算方法:每張計數200個細胞,重復3次,AI=(凋亡細胞數/200)×100%。
1.7 統(tǒng)計學處理 采用 SAS 9.1.3進行分析。同一時間點各組細胞和同組細胞不同時間點Tiam1蛋白和mRNA表達,以及各組細胞存活和AI的比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q檢驗,檢驗水準 α =0.05。
2.1 各組細胞Tiam1蛋白及mRNA的表達 見圖1、2 和表1。
表1 各組細胞Tiam1蛋白及mRNA的表達(n=3)
2.2 各組細胞存活率及AI結果 見表2。
表2 各組細胞存活率和AI %
Tiam1是從小鼠T淋巴瘤細胞中分離鑒定出來的促腫瘤轉移基因,位于第2l號染色體的 q22.1帶,具有 DH、PH 等許多重要的功能域[5]。研究[6-8]發(fā)現,Tiam1在多種腫瘤組織及細胞中均有表達。Minard等[9]對11種乳癌細胞株的研究結果表明,Tiam1蛋白表達水平越高,細胞遷移和轉移的能力越強。劉莉等[10]認為Tiam1與結直腸癌的轉移顯著相關。前期研究中作者發(fā)現腎透明細胞癌組織中Tiam1表達增強,且與腫瘤侵襲轉移有關。作者應用不同濃度的索坦干擾腎透明細胞癌株786-0,結果顯示:不同濃度的索坦處理24、48、72 h后,各組細胞Tiam1蛋白及mRNA的表達均較正常對照組下降,且隨著索坦?jié)舛仍黾?,細胞Tiam1蛋白及mRNA的表達減弱;同一濃度處理組中,隨著時間延長,Tiam1蛋白及mRNA的表達降低。另外,培養(yǎng)48 h隨索坦?jié)舛仍黾樱毎婊盥式档?,凋亡率增加?/p>
綜上所述,索坦可抑制腎癌細胞的生長,誘導細胞的凋亡,可抑制腎癌786-0細胞中Tiam1蛋白及mRNA的表達。由此作者認為Tiam1在腎癌侵襲、轉移過程中可能起到重要的作用,索坦可通過抑制Tiam1蛋白表達來抑制癌細胞生長。
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