結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)藥物外排抗原HLA-A2限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞表位預(yù)測(cè)*

陳 飛，高艷鋒，朱宇皇，祁元明

鄭州大學(xué)生物工程系鄭州450001

全球約有1/3的人口是結(jié)核的潛伏感染者，每年世界上有180萬人左右死于結(jié)核?。?］。耐藥結(jié)核分枝桿菌數(shù)量的日益增加是造成近年來結(jié)核病死灰復(fù)燃、卷土重來的重要原因［2］。結(jié)核分枝桿菌耐藥主要分天然耐藥機(jī)制和獲得性耐藥機(jī)制。獲得性耐藥主要是由于耐藥相關(guān)基因的點(diǎn)突變，而天然耐藥主要由于細(xì)胞壁的通透性障礙和活躍外排泵系統(tǒng)［3］。因此，藥物外排系統(tǒng)可以成為重要的耐藥結(jié)核治療靶點(diǎn)。近年來在動(dòng)物模型及臨床研究［4］中發(fā)現(xiàn)，CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)在抗結(jié)核感染保護(hù)性應(yīng)答中起著重要和獨(dú)特的作用。CD8+CTL對(duì)靶細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用，必須能識(shí)別靶細(xì)胞表面與相應(yīng)MHC-Ⅰ類分子結(jié)合的特異性抗原表位即CTL表位。目前研究的CD8+CTL表位主要集中在結(jié)核分枝桿菌特異的分泌蛋白上，如 ESAT-6、CFP-10、CFP-21、MPT64 及Ag85復(fù)合物等［5］，而對(duì)于膜蛋白尤其是藥物外排蛋白CD8+CTL表位報(bào)道很少，因此該研究主要針對(duì)結(jié)核藥物外排蛋白進(jìn)行CTL表位預(yù)測(cè)。

1 材料與方法

1.1 資料來源 從NCBI網(wǎng)站獲取耐藥相關(guān)藥物外排 抗 原 (Rv1634、Rv2846c、Rv2937、Rv2686c、Rv2687c及 Rv3065)的氨基酸全長序列:Rv1634(NP_216150.1)，471 個(gè)氨基酸;Rv2846c(NP_217362.1)，530 個(gè)氨基酸;Rv2937(NP_217453.1)，289個(gè)氨基酸;Rv2686c(NP_217202.1)，252個(gè)氨基酸;Rv2687c(NP_217203.1)，237個(gè)氨基酸;Rv3065(YP_177922.1)，107 個(gè)氨基酸。

1.2 分析方法

1.2.1 BLAST分析 利用 Internet網(wǎng)絡(luò)進(jìn)入 EXPASY 主頁(http://www.expasy.ch/tools/blast/)，選database(Human)，選定Identity BLAST，輸入各個(gè)蛋白的氨基酸序列后進(jìn)行比對(duì)。

1.2.2 SYFPEITHI超基序法遠(yuǎn)程預(yù)測(cè)CTL表位

預(yù)測(cè)由9個(gè)氨基酸殘基組成的CTL表位，具體方法:利用Internet網(wǎng)絡(luò)進(jìn)入SYFPEITHI主頁(http://www.syfpeithi.de/)，選擇 Epitope-prediction 進(jìn)入CTL表位預(yù)測(cè)界面。對(duì)Rv1634/Rv2846c/Rv2937/Rv2686c/Rv2687c/Rv3065的HLA-A*0201限制性CTL表位進(jìn)行遠(yuǎn)程預(yù)測(cè)，對(duì)分值較高的表位進(jìn)一步進(jìn)行分析。

1.2.3 BIMAS量化基序法預(yù)測(cè)分析 利用Internet網(wǎng)絡(luò)進(jìn)入 BIMAS 主頁(http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/)，選定預(yù)測(cè)抗原肽長度(9)、CTL表位限制性MHC類型(HLA-A*0201)，將已獲得的抗原氨基酸全長輸入待預(yù)測(cè)序列框，運(yùn)行遠(yuǎn)程預(yù)測(cè)程序，獲得預(yù)測(cè)結(jié)果。

1.2.4 NetCTL預(yù)測(cè)分析 利用Internet網(wǎng)絡(luò)進(jìn)入NetCTL 主 頁 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/)，預(yù)測(cè)由9個(gè)氨基酸組成的CTL表位，選定supertype(A2)，閾值(0.75)，輸入氨基酸序列后進(jìn)行在線預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果

6個(gè)結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)藥物外排抗原與人類蛋白進(jìn)行BLAST分析的結(jié)果見表1。

表1 結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)外排抗原與人類蛋白進(jìn)行BLAST分析的結(jié)果

通過比較選擇共篩選出21個(gè)HLA-A2限制性CTL 優(yōu)勢(shì)表位，分別為:Rv1634 54-62，170-178，184-192，248-256;Rv2846c 63-71，277-285，383-391，464-472;Rv2937 168-176，262-270，266-274，269-277;Rv2686c 74-82，151-159，181-189，184-192;Rv2687c 89-97，96-104，151-159;Rv3065 6-14，28-36(表2)。

表2 結(jié)核分枝桿菌外排抗原HLA-A2限制性CTL表位預(yù)測(cè)結(jié)果

3 討論

Bay等［6］發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌H37Rv株Rv1634基因編碼一種假想的易化超家族(MFS)類外排泵Rv1634。當(dāng)其在恥垢分枝桿菌過表達(dá)時(shí)，氟喹諾酮類藥物敏感性降低，呈現(xiàn)出低水平耐藥，提示這個(gè)外排泵與氟哌酸和環(huán)丙沙星外排有關(guān)。

EfpA(Rv2846c)是結(jié)核分枝桿菌H37Rv的外排泵蛋白，其二級(jí)結(jié)構(gòu)與QacA轉(zhuǎn)運(yùn)家族(細(xì)菌及酵母中調(diào)節(jié)抗抗生素和化學(xué)藥物抗性的蛋白家族)有很高相似性。從恥垢分枝桿菌基因組中克隆efpA基因，將之轉(zhuǎn)染恥垢分枝桿菌MC2155后，敲除efpA對(duì)氟喹諾酮、溴乙錠及吖錠黃敏感性提高［7］。

drrA、drrB可編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體，其具有泵功能的結(jié)構(gòu)是DrrA2B2。Pradhan等［8］證明，drrB 表達(dá)需要與上游drrA翻譯偶聯(lián)，用替代基因替代drrA，發(fā)現(xiàn)drrB表達(dá)過度，因此，兩者共同偶聯(lián)才會(huì)在耐藥機(jī)制中發(fā)揮作用。Rao等［9］研究發(fā)現(xiàn)，drrAB表達(dá)時(shí)恥垢分枝桿菌表現(xiàn)出對(duì)利福平、四環(huán)素、紅霉素等一系列結(jié)構(gòu)不同的臨床常用抗生素耐藥。

Rv2686c-Rv2687c-Rv2688c這3個(gè)基因是共同表達(dá)的。研究這3個(gè)基因完整的操縱子及分別研究每一個(gè)基因的耐藥情況及蛋白功能發(fā)現(xiàn)，過度表Rv2686c-Rv2687c-Rv2688c的恥垢分枝桿菌MC2155，對(duì)環(huán)丙沙星高度耐藥;而僅Rv2686c過度表達(dá)時(shí)，對(duì)環(huán)丙沙星中度耐藥［10］。

Mmr在分枝桿菌的小耐多藥性家族(SMR家族)中。將結(jié)核分枝桿菌的mmr基因轉(zhuǎn)染至恥垢分枝桿菌MC2155，后者顯示出對(duì)紅霉素和溴乙錠等耐藥，而對(duì)利福平和鏈霉素等則無變化［7］。敲除mmr表現(xiàn)對(duì)氟喹諾酮、溴乙啶及吖啶黃敏感性提高，該耐藥表型由依賴能量的外排泵介導(dǎo)。微陣列分析發(fā)現(xiàn)mmr具有異煙肼、乙胺丁醇耐藥性［11］。

隨著生物信息學(xué)和互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫的發(fā)展和積累，利用共享的專業(yè)表位預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫，綜合分析結(jié)合力、結(jié)合半衰期、酶切位點(diǎn)等多項(xiàng)信息，成為當(dāng)前表位預(yù)測(cè)主流方法。其基本理論依據(jù)為:某一特定類型的MHC-Ⅰ類分子可與多種不同的肽結(jié)合，但這些不同的抗原肽具有共同特點(diǎn)，即某些位置總是某一種或幾種具有相似側(cè)鏈或化學(xué)性質(zhì)的氨基酸出現(xiàn)的頻率比較高，對(duì)肽與某一特定MHC-Ⅰ類分子之間的結(jié)合起決定作用。針對(duì)某一MHC-Ⅰ類分子和固定長度肽，可得出各種氨基酸殘基在各個(gè)位置的結(jié)合力評(píng)分，成為一個(gè)集合。目前已得到多種MHC-Ⅰ類分子的氨基酸結(jié)合力預(yù)測(cè)集合，構(gòu)成了預(yù)測(cè)T細(xì)胞抗原表位的基礎(chǔ)［12］。

NetCTL是近年來發(fā)展起來的整合預(yù)測(cè)程序，它綜合了抗原肽提呈效率和酶切位點(diǎn)的打分，與目前公認(rèn)的兩大預(yù)測(cè)程序SYFPEITHI和BIMAS形成很好的互補(bǔ)［13］。SYFPEITHI和BIMAS都是基于抗原肽與MHC-Ⅰ類結(jié)合特性而建立起來的方法，未考慮針對(duì)抗原加工處理過程的預(yù)測(cè)，因此將兩程序的預(yù)測(cè)結(jié)果再綜合NetCTL進(jìn)行分析，實(shí)現(xiàn)兩類不同機(jī)制預(yù)測(cè)程序的有機(jī)結(jié)合，可以提高表位預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確率。聯(lián)合使用多種基于不同運(yùn)算法則的預(yù)測(cè)軟件，可以減少傳統(tǒng)預(yù)測(cè)方式的大工作量而且縮短時(shí)間。但是這也存在不足，表位預(yù)測(cè)方式并不能100%的將所有的優(yōu)勢(shì)表位都預(yù)測(cè)到，有些優(yōu)勢(shì)表位會(huì)被漏掉。

綜上所述，盡管存在不足，這些表位仍有很大的可能是HLA-A2限制性CD8+CTL的優(yōu)勢(shì)表位，篩選表位后通過進(jìn)一步的CTL表位鑒定可為以后基于CTL表位肽的免疫治療及開發(fā)抗結(jié)核亞單位疫苗提供基礎(chǔ)。

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