氫溴酸西酞普蘭咀嚼片人體生物利用度和生物等效性研究

張麗娟，李海燕，郝光濤，劉澤源

西酞普蘭為選擇性很強(qiáng)的5-羥色胺攝取抑制劑(SSRI)，其抗抑郁作用是抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的5-羥色胺能神經(jīng)元對(duì) 5-羥色胺的再攝?。?］，同時(shí)對(duì)膽堿能毒蕈堿受體、組織胺受體和α-腎上腺素能受體無(wú)抑制作用［2］，因此，會(huì)減少很多抗抑郁藥物引起的毒副作用，如口干、鎮(zhèn)靜、體位性低血壓等［3］。西酞普蘭對(duì)肝臟細(xì)胞色素P450代謝酶影響很?。?］，因此，臨床上有較強(qiáng)的抗抑郁作用，不良反應(yīng)和藥物間相互作用較少，安全范圍大。常用在抑郁癥的急性期和長(zhǎng)期維持治療，可使患者的《兒童抑郁評(píng)分量表—改良版(CDRS-R)》評(píng)分獲得改善［5］，尤其適用于老年及共病軀體疾病抑郁癥患者的治療［6］。本試驗(yàn)考察國(guó)產(chǎn)氫溴酸西酞普蘭咀嚼片與進(jìn)口氫溴酸西酞普蘭片的生物等效性［7］，為臨床安全、合理用藥提供理論依據(jù)。

1 材料、對(duì)象和方法

1.1 藥品試劑與儀器

1.1.1 藥品與試劑 氫溴酸西酞普蘭咀嚼片(昆明積大制藥有限公司提供，10 mg/片，批號(hào):100301);氫溴酸西酞普蘭片(商品名:喜普妙，丹麥靈北藥廠生產(chǎn)，20 mg/片，批號(hào):2202204);氫溴酸西酞普蘭對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，含量:99%，批號(hào):100790-200501);內(nèi)標(biāo):鹽酸苯海拉明(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào):100066-200807);甲醇和乙腈均為色譜純(DIMA公司);其他試劑為分析純。

1.1.2 儀器 API 3000型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子化源以及Analyst 1.4.2數(shù)據(jù)處理軟件(美國(guó)Applied Biosystem公司);Agilent 1200高效液相色譜系統(tǒng)，包括四元輸液泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、切換閥(美國(guó)Agilent公司);GL-88B旋渦混合儀(海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司);AB104電子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司);2K-15高速低溫離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司);Milli-Q Plus純水器(美國(guó)密理博中國(guó)有限公司)。

1.2 受試者選擇 24例中國(guó)健康男性受試者的平均年齡為(24.5±3.2)歲，身高(1.69±0.06)m，體重(60.7±4.6)kg，體重指數(shù)為(21.37±1.33)kg/m2。試驗(yàn)前生命體征、血常規(guī)、尿常規(guī)、肝功能、腎功能、心電圖及胸透等檢查未發(fā)現(xiàn)異常。受試前2周未服用任何其他藥物，受試者均自愿參加并簽署知情同意書(shū)。

1.3 給藥方案與血樣采集 本試驗(yàn)采用雙周期、隨機(jī)、自身交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)在解放軍307醫(yī)院I期臨床試驗(yàn)病房進(jìn)行。

24名健康受試者隨機(jī)進(jìn)入2個(gè)試驗(yàn)組，每組12名。每組受試者每次試驗(yàn)時(shí)分別服用受試制劑或參比制劑。受試制劑空腹咀嚼30～60 s后直接吞咽，參比制劑空腹用200mL溫開(kāi)水送服。服藥后2 h方可再飲水，4 h后統(tǒng)一進(jìn)食低脂標(biāo)準(zhǔn)餐。兩次用藥間隔2周。本試驗(yàn)兩種制劑的服用劑量均為20 mg，一次服用。

分別于給藥前及給藥后 1、2、3、4、6、8、12、24、36、48、72、96、120、144 h 各取靜脈血5mL 左右置于肝素處理的試管中，靜置約0.5 h，3000 r/min離心10min，分離血漿;血漿樣品置－20℃冰箱保存。

1.4 樣品測(cè)定方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 西酞普蘭標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:精密稱(chēng)取氫溴酸西酞普蘭對(duì)照品12.5 mg，置于50mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得200μg/mL西酞普蘭的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，取該儲(chǔ)備液以甲醇依次稀釋?zhuān)涑蓾舛确謩e為100μg/L、50μg/L、25μg/L、10μg/L 、2.5μg/L、1μg/L、0.5μg/L 的西酞普蘭標(biāo)準(zhǔn)溶液。內(nèi)標(biāo)(苯海拉明)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:精密稱(chēng)取鹽酸苯海拉明對(duì)照品5.7 mg，置于25mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得200μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，倍比稀釋該儲(chǔ)備液至10μg/L，對(duì)照品溶液于4℃冰箱保存作為內(nèi)標(biāo)待用。

1.4.2 色譜條件 色譜柱:Agilent-ZORBAX-C8柱(4.6mm ×150mm，5μm)，流動(dòng)相:乙腈∶0.1%甲酸水溶液 =60∶40;流速:0.5mL/min;柱溫:20 ℃;進(jìn)樣量:10μL。

1.4.3 質(zhì)譜條件 離子源:電噴霧離子化源(ESI源);離子極性:正離子(Positive);離子檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)方式;噴射電壓:5400 V;離子源溫度:450℃;源內(nèi)氣體1(GS1，N2)壓力:8 psi;源內(nèi)氣體2(GS2，N2)壓力:7 psi;氣簾氣體(N2)壓力:6 psi;碰撞能量(CE):27 V(西酞普蘭)、13V(苯海拉明);碰撞能量(DP):50 V(西酞普蘭)、30V(苯海拉明);碰撞氣(CAD，N2)壓力:6 psi;用于定量分析的離子反應(yīng)對(duì)分別為質(zhì)荷比 m/z 325.1→m/z 262.1(西酞普蘭)和m/z 256.2→m/z 167.1(苯海拉明，內(nèi)標(biāo))。

1.4.4 血漿樣品分析方法 準(zhǔn)確量取50μL血漿樣品于一潔凈EP管中，加入50μL內(nèi)標(biāo)溶液(10μg/L 苯海拉明甲醇溶液)，補(bǔ)加 1050μL 甲醇溶液，混合均勻，4℃、15000 r/min離心10min，取上清液800μL，40 ℃ 水浴氮?dú)鈸]干，150μL純水復(fù)溶，進(jìn)樣10μL進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。

1.5 方法學(xué)考察與評(píng)價(jià)

1.5.1 質(zhì)譜分析 取西酞普蘭和苯海拉明標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋成濃度為1μg/mL的甲醇液，按“1.4.3”項(xiàng)操作，相應(yīng)的二級(jí)全掃描質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 西酞普蘭和內(nèi)標(biāo)苯海拉明的產(chǎn)物離子質(zhì)譜掃描圖

1.5.2 特異性 分別取6例受試者的空白血漿進(jìn)行方法特異性考察。結(jié)果表明，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾西酞普蘭和苯海拉明的測(cè)定。見(jiàn)圖2。

1.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限 取空白血漿50μL，分別精密加入標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的西酞普蘭對(duì)照品溶液50μL 和內(nèi)標(biāo)溶液50μL，旋渦混勻，配成含西酞普蘭的濃度分別為 0.5、1、2.5、10、25、50、100μg/L的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿，按“1.4.4”項(xiàng)下操作，記錄色譜圖，計(jì)算西酞普蘭峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值f(f=As/Ai)。以血漿中待測(cè)物濃度(X)為橫坐標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值(Y)為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算［8］，求得回歸方程:Y=0.0399X-0.00309，r=0.9979，權(quán)重系數(shù)w=1/x2。按上述條件測(cè)得的西酞普蘭在血漿中的定量下限為0.5μg/L。

圖2 血漿中西酞普蘭和內(nèi)標(biāo)苯海拉明的典型MRM色譜圖(I西酞普蘭;II苯海拉明)

1.5.4 精密度和準(zhǔn)確度(相對(duì)回收率)按“1.4.4”項(xiàng)下操作。每天做1批及1條隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，連續(xù)做3 d，共3批，每批每個(gè)濃度做6份樣品，記錄色譜圖，計(jì)算西酞普蘭峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值f，代入當(dāng)天的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得實(shí)測(cè)濃度，計(jì)算批內(nèi)、批間精密度和準(zhǔn)確度(相對(duì)回收率)。見(jiàn)表1。

表1 血漿中西酞普蘭的批內(nèi)、批間精密度(RSD)和準(zhǔn)確度(相對(duì)回收率)(%，n=18)

1.5.5 樣品穩(wěn)定性 西酞普蘭檢測(cè)樣品進(jìn)樣器中放置6 h、血漿樣品在室溫放置4 h及－40℃ 反復(fù)凍融3次及－40℃ 凍存2個(gè)月條件下，進(jìn)行樣品穩(wěn)定性考察，RE均在±15%內(nèi)，穩(wěn)定性良好。

1.6 數(shù)據(jù)處理 用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的計(jì)算:根據(jù)血藥濃度-時(shí)間曲線計(jì)算每個(gè)受試者口服受試制劑及參比制劑后的血藥濃度。根據(jù)血藥濃度-時(shí)間曲線末端直線部分的試驗(yàn)點(diǎn)，以lnC對(duì)t進(jìn)行回歸，求得消除速率常數(shù)ke;T1/2=0.693/ke;Cmax、Tmax為試驗(yàn)的實(shí)測(cè)值，以梯形面積法計(jì)算 AUC0-tn，AUC0-∞=AUC0-tn+Ctn/ke(tn為最后一次可檢測(cè)血藥濃度的采樣時(shí)間;Ctn為末次可測(cè)定樣品的藥物濃度);CL/F=D/AUC0-∞(D為給藥劑量);Vd/F=CL/F/Ke。相對(duì)生物利用度 F，以公式計(jì)算:F=(AUCT×DR)/(AUCR×DT)×100%(T為受試制劑，R為參比制劑，D為劑量)。

2 結(jié)果

2.1 血藥濃度-時(shí)間曲線 24例受試者服用受試制劑和參比制劑后西酞普蘭血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖3。

圖3 受試者服用受試制劑和參比制劑后血漿中西酞普蘭平均血藥濃度-時(shí)間曲線

2.2 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)和生物利用度 受試者單次口服受試制劑及參比制劑后的平均藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 受試者單次口服T和R后西酞普蘭的平均藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.3 生物等效性評(píng)價(jià) 將藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Cmax、AUC0-tn和AUC0-∞經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析，雙單側(cè)t檢驗(yàn)，計(jì)算90%置信區(qū)間，對(duì)Tmax進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。AUC0-tn、AUC0-∞、Cmax的 90% 的置信區(qū)間分別為 84.5%～96.90%、84.64%～97.03%、84.16%～96.15%。對(duì)Tmax的實(shí)測(cè)值進(jìn)行檢驗(yàn)，P＞0.05。結(jié)果表明，受試制劑與參比制劑具有生物等效性。

2.4 安全性評(píng)價(jià) 整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中未出現(xiàn)與試驗(yàn)相關(guān)的嚴(yán)重不良事件。參加試驗(yàn)的24例受試者中有7例受試者出組時(shí)出現(xiàn)尿常規(guī)和/或血生化檢查異常，血生化檢查異常的項(xiàng)目為總膽紅素、直接膽紅素、尿酸和甘油三酯一過(guò)性增高。未經(jīng)任何治療而給予密切觀察處理，一段時(shí)間后恢復(fù)正常。

3 討論

本試驗(yàn)建立的人血漿中西酞普蘭濃度的測(cè)定方法簡(jiǎn)便可靠、準(zhǔn)確性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，血藥濃度在0.5～100μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，符合氫溴酸西酞普蘭人體藥代動(dòng)力學(xué)及生物利用度研究的要求。

藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)表明，受試制劑和參比制劑在人體內(nèi)吸收、分布、消除規(guī)律較為接近。受試制劑的相對(duì)生物利用度F0-tn和F0-∞分別為91.92% ±15.10%和92.09%±15.52%。經(jīng)生物等效性評(píng)價(jià)，受試制劑和參比制劑具有生物等效性。

藥物的吸收程度和速度隨劑型不同而不同，受試制劑氫溴酸西酞普蘭片經(jīng)咀嚼30～60 s后直接吞咽，咀嚼后藥物顆粒有效面積增大，從而促進(jìn)藥物釋放與吸收，理論上受試制劑應(yīng)吸收較快。本試驗(yàn)中，受試制劑及參比制劑的實(shí)測(cè)平均達(dá)峰時(shí)間Tmax分別為(4.42±2.41)h和(5.00±2.87)h，受試制劑達(dá)峰時(shí)間比參比制劑平均提前約35min，符合咀嚼片吸收較快的趨勢(shì)，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，這可能是受試者例數(shù)較少所致。

西酞普蘭片為臨床常用藥物，經(jīng)查閱文獻(xiàn)，未發(fā)現(xiàn)藥物不良反應(yīng)中有對(duì)肝臟功能損傷的報(bào)道，使用說(shuō)明書(shū)中也未列舉該種不良反應(yīng)。但參加試驗(yàn)的24例受試者中，有7例受試者出組時(shí)出現(xiàn)尿常規(guī)和/或血生化檢查異常，血生化檢查異常的項(xiàng)目為總膽紅素、直接膽紅素、尿酸和甘油三酯一過(guò)性增高?？紤]受試者主訴無(wú)任何不適及其他臨床癥狀，其余化驗(yàn)項(xiàng)目也未見(jiàn)有臨床意義的改變，未經(jīng)任何治療而給予密切觀察處理，一段時(shí)間后恢復(fù)正常。分析治療后化驗(yàn)結(jié)果異常原因，不排除受試者在住院期間體力活動(dòng)減少及試驗(yàn)期間作息與飲食改變引起的指標(biāo)一過(guò)性異常。綜合以上因素，判斷此不良反應(yīng)與試驗(yàn)藥物可能有關(guān)。

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