東方百合“索蚌”自交不親合性的研究

栗艷齡，梁建萍，馬躍龍，羅鳳霞

（1.山西農(nóng)業(yè)大學 信息學院，山西 太谷 030801;2.山西農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，山西 太谷 030801;3.金陵科技學院 園藝學院，江蘇 南京 210038)

東方百合“索蚌”自交不親合性的研究

栗艷齡1，梁建萍2，馬躍龍1，羅鳳霞3

（1.山西農(nóng)業(yè)大學 信息學院，山西 太谷 030801;2.山西農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，山西 太谷 030801;3.金陵科技學院 園藝學院，江蘇 南京 210038)

為研究百合自交不親和發(fā)生的部位，以東方百合索蚌為試驗材料，采用蕾期授粉、切割花柱授粉、延后授粉對東方百合索蚌自交后的花粉管生長和結實進行了研究。結果表明：索蚌自交不親和性表現(xiàn)在花柱和子房中;蕾期授粉具有明顯的花柱不親和性;保留0.5cm花柱授粉能夠克服花柱不親和，花粉管可以進入子房，但坐果率為零，受精障礙存在于子房;延后6d柱頭授粉能夠克服索蚌的自交不親和性，結實率可以達到26.7%，但每果有胚4.0個。

索蚌;不親和;花粉管;結實

自交不親和性也叫自交不育性，是指能產(chǎn)生具有正常功能且同期成熟的雌雄配子的雌雄同體植物，在自花授粉或相同基因型異花授粉時不能完成受精的現(xiàn)象，是花粉與雌蕊之間表現(xiàn)抑制作用所致，實質上是自花授粉時受精過程受阻。百合科的成熟花粉粒是由一個營養(yǎng)細胞和一個生殖細胞構成的二核花粉粒。根據(jù)孟金陵［1］所述，具二核花粉粒的物種表現(xiàn)為配子體不親和性，所謂配子體不親和性，是指花粉的不親和反應是由花粉本身（配子體)的單倍體基因型決定的。在配子體不親和反應中，共同細胞質中不存在特異物質，而特異物質是在各個小孢子內(nèi)形成的。所以，這類植物的花粉可以萌發(fā)并進入花柱。但是，當花粉中的特異物質與花柱中的相應物質由于擴散而發(fā)生反應時，花粉管的生長就會停止，不親和性表現(xiàn)在花柱內(nèi)。針對百合不親和性的特點，克服其方法大體上有切除柱頭、切割花柱，應用化學調(diào)節(jié)劑，蕾期授粉和延遲授粉，離體授粉，混和花粉授粉，子房內(nèi)授粉，染色體加倍，輻射花粉，熱助授粉，注意正反交、改變雜交親本染色體倍數(shù)、橋梁雜交等［2，3］。

索蚌“Sorbonne”是東方百合的一個品種，育種試驗中發(fā)現(xiàn)其具有很高的自交不親和性，得不到后代。本試驗采用蕾期授粉、切割花柱授粉、延遲授粉三種常用克服不親和性的試驗方法，運用熒光顯微法觀測，結合留種試驗，目的在于研究百合自交不親和發(fā)生的部位及克服百合自交不親和的有效方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

東方百合雜交種索蚌“Sorbonne”

1.2 試驗方法

1.2.1 花蕾級別判定

設開花當天的花蕾為0級，開花前2d的花蕾為－2級，開花后2d的花蕾為＋2級，依次類推，直到－6級和＋6級（見表1)。

1.2.2 授粉方法

－6到－2級別的花在授粉前1d去雄，其余級別的花均在開花前1d去雄，對開花當天0級的花采用常規(guī)柱頭授粉（對照)，僅切柱頭授粉以及切掉1／2花柱授粉，保留0.5cm花柱授粉4種授粉方法，其余級別的花蕾均采用常規(guī)柱頭授粉，每一級別或每種授粉方式均授50朵，授粉時間定在每天上午8：30～10：00。加強對留種母株的養(yǎng)護管理，兩個月后采摘果實，測量其長和寬，計算蒴果的膨大系數(shù)，膨大系數(shù)＝果實膨大寬度／果實長;統(tǒng)計其坐果率和有胚種子率，坐果率（%)＝坐果數(shù)／授粉數(shù)×100，有胚種子率（%)＝有胚胚珠數(shù)／子房中胚珠數(shù)×100。

1.2.3 花粉管生長狀態(tài)觀察

授粉后4、24、48、96、144h，取下花柱和子房放入FAA固定液（甲醛∶冰乙酸∶70%酒精＝1∶1∶18體積比)中，每個處理5個，固定24h后，放入75%酒精保存?zhèn)溆?。然后再將樣品放? mol·L－1NaOH溶液中，60℃下進行軟化至全透明狀，再用蒸餾水清洗3次去除NaOH，放入0.1%水溶性苯胺藍（0.1mol·L－1K3PO4)溶液中染色24h，用BH-2型Olympus熒光顯微鏡觀測、記錄、拍照。

2 結果與分析

2.1 不同級別花蕾授粉后花粉管生長行為觀察

由表1和圖1綜合分析可知，授粉后4h，對照，＋2，＋4，＋6級花蕾授粉花粉粒均萌發(fā)，花粉管呈黃綠色（見圖2中1)，生長情況幾乎無差別，其余級別花蕾和切割花柱授粉花粉粒仍處于靜止狀態(tài)或少數(shù)透亮，此時，－2、－4、－6級花蕾和切割花柱授粉的花粉粒缺乏柱頭分泌的粘液，導致花粉萌發(fā)慢，說明柱頭分泌物中可能含有促進花粉萌發(fā)的物質。

圖1 不同級別花蕾授粉后花粉管生長長度Fig.1 The length of pollen tube growth to different grades buds after pollination

表1 索蚌各級花蕾調(diào)查情況Table 1 The investigation of different buds in Sorbonne

授粉后24h，對于‘＋’級花蕾，隨著級別的增加，花粉萌發(fā)的越多，花粉管伸長的越長，且花粉管突破柱頭乳突組織向花柱道中延伸的數(shù)量也增加（見圖2中2、3、4)，‘－’級花蕾，僅是零星萌發(fā)（見圖2中5、6)。

授粉后48h，花蕾級別越高，花粉管延伸的越長，＋6級的花粉管已經(jīng)超過了整個花柱的1／5，對照的花粉管剛接近花柱的1／6，－2級花粉管突破柱頭乳突組織有向下延伸的跡象（見圖2中7)，－4，－6級還停留在乳突，且花粉管數(shù)量仍未增加，未萌發(fā)花粉也沒有要萌發(fā)的跡象（見圖2中8)，切頭和切1／2花柱的花粉管伸長的沒有對照長，且后者要比前者花粉管數(shù)量少，說明上部花柱的存在可能對花粉管生長有一定促進作用，可以嘗試采用上部花柱與子房嫁接授粉方法。保留0.5cm花柱的花粉管剛到達子房口（見圖2中9)。

授粉后96h，對照中花粉管到達花柱的1／4，＋6級花粉管穿過花柱的1／3，＋2，＋4級花粉管長度處于對照和＋6級中間，－2級花粉管延伸還不到花柱的1／6，－4，－6級花粉管幾乎沒伸長，處于停滯狀態(tài)（見圖2中10、11)，切頭后花粉管伸長的長度比切1／2花柱的長，保留0.5cm花柱的花粉管已進入子房與胚珠結合（見圖2中12)，說明保留0.5cm花柱授粉能夠克服下部花柱對花粉管生長的抑制作用。

授粉后144h，對于延后授粉，依然是隨延后時間的增加，花粉管伸長的越長，且花粉管數(shù)量也逐級增加（見圖2中13、14、15)，＋6級花粉管到達花柱的2／3，對照中花粉管還未達花柱的1／3，＋2，＋4級花粉管長度超過花柱的1／3，－2級花粉管也延伸到花柱的1／5，－4，－6級花粉管依然是零增長，切頭的和切1／2花柱的花粉管長度達到整個花柱的1／4。

由此可見，花蕾級別越高，花器官發(fā)育得越成熟，花粉管生長得越好，說明成熟的花器官為花粉管的生長創(chuàng)造了良好的條件，根據(jù)楊曉苓［4］對雌蕊中保護酶和激素的研究及Iwanami Y［5］對花粉管生長的研究，推測柱頭、花柱、子房中積累了大量促進花粉管生長的物質，在分泌細胞的引導下，花粉管向下生長。另外，在切割花柱授粉中，發(fā)現(xiàn)下部花柱對花粉管的抑制程度大于上部花柱，保留0.5 cm花柱授粉是相對有效的。

2.2 不同級別花蕾授粉對結實的影響

由表2可知，隨著花蕾級別的增加，子房膨大個數(shù)和膨大系數(shù)也在增加，但花蕾只有在＋6級時授粉有效，且坐果率達26.7%，這說明延后6d授粉，花冠部分更趨于成熟，柱頭、花柱、子房、胚珠更具備了受精能力，抑制花粉管生長的脫落酸等物質不會對花粉管造成影響，但有胚種子率相對較低，推測遲遲來到的精子與卵細胞生理結構不相匹配，不能完成正常受精，也許是受精后早期胚敗育，需要適時進行早期子房切片、胚珠或幼胚離體培養(yǎng);

圖2 不同級別花蕾授粉后花粉管生長狀況Fig.2 The condition of pollen tube growth to different grades buds after pollination

表2 索蚌各級花蕾授粉結實情況Table 2 The seeds of different grades＇buds after pollination in Sorbonne

＋2、＋4級授粉后膨大系數(shù)也相對較高，這與花粉管伸長的長度較長是相對應的，但坐果率為零，可能是由于花粉管伸長得越長，釋放的雄激素信號傳遞到子房越快，對子房刺激作用越大造成的，也可能是由幼胚早期敗育引起的;

切割花柱授粉中，切1／2花柱和保留0.5cm花柱授粉后的子房都呈膨大現(xiàn)象，且后者子房膨大系數(shù)接近延后6d授粉子房膨大系數(shù)，發(fā)現(xiàn)依然未坐果。先前觀察到后者花粉管于授粉后96h已到達胚珠（見圖2中12)，說明切割花柱授粉能夠影響花粉管的生長，切得越長，花粉管進入子房的可能性越大，同時推測由于缺少花柱的緩沖作用，使得進入子房花粉管的數(shù)量減少，這樣就減少了受精的機會，而得不到有胚種子;也可能是后期胚敗育;也許是花粉管提前進入子房，雌雄配子生理上存在差異，可以嘗試延后6d的切割花柱授粉，以上情況有待進一步研究。

－2、－4級花蕾授粉，子房輕微膨大，此時花冠部分并未成熟，尤其是先端柱頭還未分泌粘液，不能使花粉更好地萌發(fā)，萌發(fā)的花粉也由于花柱的不成熟，花粉管不能健康生長，導致后期受精障礙;

0級花蕾授粉，子房膨大系數(shù)不及切割花柱（除切柱頭)和延后授粉的子房膨大系數(shù)，此時花冠部分基本成熟，可能花柱中促進花粉管生長的物質還未產(chǎn)生或某些抑制花粉管生長的物質產(chǎn)生，導致花粉管畸形生長，后期發(fā)生受精障礙，因此，－2、－4級和0級授粉均無效，不能坐果結籽。－6級花蕾各花器過于幼嫩，授粉也無效。

3 結論與討論

采用蕾期常規(guī)授粉不能克服索蚌自交不親和性，存在著花柱障礙，授粉不成功。一方面缺乏了柱頭分泌物，另一方面也許是花粉中的特異物質與未成熟花柱中的相應物質發(fā)生反應，阻礙花粉管生長。據(jù)Shivanna［6］研究，認為蕾期授粉是克服自交不親和性最為成功的方法?？梢姡倨谑诜鄯绞皆谧越徊挥H和應用方面有一定的局限性。

采用保留0.5cm花柱授粉能夠克服花柱不親和，但不能克服子房不親和。據(jù)齊國輝［7］研究報道，梨花柱中高水平的IAA、GA3和ZR有利于授粉受精正常進行，花柱中低水平的生長促進物質IAA、GA3和ZR使自交不親和不結實。楊曉苓［4］也報道，自交親和、雜交不親和均能引起雌蕊中保護酶和激素的協(xié)同作用。切1／2花柱和保留0.5 cm花柱授粉效果優(yōu)于切柱頭授粉，子房膨大系數(shù)可觀，但沒有坐果，可能是花柱中缺乏IAA、GA3和ZR內(nèi)源激素及酶活性的誘導，導致后期受精發(fā)生障礙，也許是雌雄生殖器官生理上的差異或早期胚敗育，仍需進一步對受精過程中各項生理指標進行研究。

采用延后6d授粉有效，能夠克服索蚌的自交不親和性。前人［8～10］研究發(fā)現(xiàn)，花粉管尖端有大量鈣離子通道分布，它們開放后會使花粉管前端形成一定的鈣離子濃度梯度，該梯度控制著花粉管伸長生長的速度和方向。據(jù)張紹鈴［11］研究報道，梨花柱中存在一種特異性的降解自花花粉管RNA的核糖核酸酶。據(jù)楊曉苓［4］等研究，不親和授粉雌蕊中ABA始終高于自交授粉，高水平的ABA與雜交不親和授粉有關。推測花器官發(fā)育越成熟，花粉管前端鈣離子通道越開放，更容易控制花粉管伸長速度和方向;同時，降解自花花粉管RNA的核糖核酸酶和ABA含量的合成也減少，這樣對花粉管生長和受精的阻礙作用就減小，致使子房膨大系數(shù)較高，但坐果率僅26.7%，種子有胚率只有1.51%，說明提高索蚌自交結實率還需在胚搶救方面進一步研究探討。

可見，索蚌的不親和性在花柱和子房中都存在，要想徹底搞清楚，除了采用多種克服自交不親和性的方法之外，還需要從生理指標和分子水平上對受精過程中雌蕊產(chǎn)生的物質進行測定和研究，以期為百合雜交育種工作排除受精障礙提供一定的理論基礎。

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Study on the Self-incompatibility inLiliumorentialSorbonne

LI Yan-ling1，LIANG Jian-ping2，MA Yue-long1，LUO Feng-xia3
（1.CollegeofInformation，ShanxiAgriculturalUniversity，TaiguShanxi030801，China;2.CollegeofLifeSciences，ShanxiAgriculturalUniversity，TaiguShanxi030801，China;3.CollegeofHorticulture，JinlingInstitute ofTechnology，NanjingJiangsu210038，China)

In order to study the position of self-incompatibility inLilium，withLiliumorentialSorbonne as material，pollen tube＇s growth and seed formation inLiliumorentialSorbonne inLiliumwere studied by bud pollination，cut-different-style pollination and delayed pollination.The results suggested that the self-incompatibility in Sorbonne manifested in style and ovary.The pollination on buds showed apparant style incompatibility.Retaining 0.5cm style pollination could bypass style incompatibility，the pollen tube could get into the ovary，but the fruit-setting rate was zero and the fertilization failure existed in ovary.The delayed 6dstigma pollination could overcome self-incompatibility in Sorbonne and the fruit-setting rate was 26.7%，but the number of embryos was four in every fruit.

Sorbonne;Self-incompatibility;Pollen tube;Seeds

S682.2

A

1671-8151（2011)06-0506-06

2011-06-20

2011-08-20

栗艷齡（1981-)，女（漢)，山西長治人，助教，碩士，主要從事花卉遺傳育種方面的研究。

江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新資金項目（CX（09)608)

（編輯：武英耀)