超聲聯(lián)合反義c-myc寡核苷酸對(duì)移植靜脈內(nèi)膜增生的影響

劉楊東,趙 渝,時(shí) 德,彭真年,廖曉剛

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血管外科 400016;2.重慶醫(yī)科大學(xué)病理教研室 400016;3.重慶醫(yī)科大學(xué)電鏡教研室 400016)

有研究發(fā)現(xiàn),超聲輻照可以誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cell,SMC)的凋亡,抑制SMC的增生,超聲輻照還可以促進(jìn)外源基因在培養(yǎng)的血管細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。而局部應(yīng)用人工合成的反義寡核苷酸能有效地抑制移植靜脈內(nèi)膜的增生。現(xiàn)將利用超聲輻照聯(lián)合局部應(yīng)用反義核苷酸影響移植靜脈的研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物及分組 新西蘭大白兔(重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)24只,雌雄不論,體質(zhì)量3.0～3.5 kg,將其隨機(jī)分為4組,每組6只。(1)對(duì)照組:靜脈移植術(shù)后僅常規(guī)術(shù)后處理。(2)超聲輻照組:靜脈移植術(shù)后即日到第7天用超聲(0.8 MHz,2.190 W/cm2)輻照2 min,間隔1 min,重復(fù) 1次。(3)反義核苷酸組:探頭與皮膚間涂超聲耦合劑,將溶有吸光值(optical density,OD)為10(約300 μ g)反義c-myc的醫(yī)用生物蛋白膠均勻涂于移植血管外膜,待蛋白膠充分凝固后,縫合傷口。(4)超聲輻照加反義核苷酸組:局部應(yīng)用c-myc加超聲輻照。

1.2 建立模型 頸正中切口,取同側(cè)頸內(nèi)靜脈約2 cm處置入離斷的頸總動(dòng)脈,9-0 prolene縫線間斷外翻縫合,術(shù)后皮下注射肝素6 250 U。

1.3 儀器 超聲輻照儀(重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)超聲工程研究所研制,頻率為0.8 MHz);聲功率(武漢中國聲學(xué)研究所聲功率測定儀,聲強(qiáng)強(qiáng)度可調(diào)范圍為 1.512～3.904 W/cm2)。

1.4 反義C-myc寡核苷酸序列 根據(jù)兔c-myc cDNA序列選擇相應(yīng)mRNA翻譯起始位點(diǎn)AUG后15和18個(gè)堿基設(shè)計(jì)反義序列(表 1)。5′-GAC GTT GAG GGG CAT-3′由上海生工DNA自動(dòng)合成儀上合成,經(jīng)高壓液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)純化、凍干保存,5′和 3′端各3個(gè)磷酸二酯鍵硫代磷酸修飾。PCR引物的設(shè)計(jì)根據(jù)基因庫中兔c-myc序列,按PCR引物設(shè)計(jì)要求,經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件分析設(shè)計(jì),同時(shí)設(shè)計(jì)310 bpβ-actin引物作為內(nèi)對(duì)照序列。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列

1.5 影像學(xué)檢查 術(shù)后第2、4周分別對(duì)移植側(cè)頸總動(dòng)脈及移植靜脈作彩色多普勒超聲(彩超)和數(shù)字減影血管造影(digital subtraction angiography,DSA)檢查,了解其通暢情況。并于取標(biāo)本前細(xì)心解剖出移植血管近端頸總動(dòng)脈,插入3F導(dǎo)管,快速推注碘海醇10 mL,行DSA。完畢,導(dǎo)管內(nèi)注入肝素生理鹽水,并保留導(dǎo)管。

1.6 原位灌注固定及標(biāo)本取材 從造影保留導(dǎo)管注入4%多聚甲醛(含2%戊二醛),待血管內(nèi)血液沖洗干凈后結(jié)扎遠(yuǎn)心端頸總動(dòng)脈,保持100 cm H2O壓力,充分固定 45 min。取下所需血管段,分別固定于4%多聚甲醛和預(yù)冷(4℃)的4%戊二醛中,以備光鏡和電鏡制片。

1.7 移植血管RNA提取 術(shù)后第14天,游離出移植的靜脈,取含吻合口在內(nèi)的全部移植血管,每組4條血管,置液氮中保存。組織總RNA的提取按異硫氰酸胍-酶-氯仿一步法進(jìn)行。

1.8 反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription,RT-PCR)反應(yīng) 取1～5μ g RNA模板樣品加雙蒸水(dd H2O)至11 μ L,按逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒說明書步驟加入反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增,每一反應(yīng)體系加入c-myc上、下游引物和β-actin內(nèi)參引物各1 μL(18 μ mcc/L)。PCR儀擴(kuò)增條件為94℃1 min,60℃1 min,72℃90 s,共計(jì)30次循環(huán),最后72℃延伸10 min。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SAS 6.12軟件系統(tǒng)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn),計(jì)量資料采用 t檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

所有實(shí)驗(yàn)兔術(shù)后均存活,彩超和DSA發(fā)現(xiàn)除對(duì)照組第4周有1例閉塞外,其余移植血管均通暢。

2.1 組織形態(tài)學(xué)觀察 光鏡觀察各組移植靜脈腔面均有一層內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋,其下為增生的內(nèi)膜,主要由大量細(xì)胞外基質(zhì)和SMC組成,第4周較第2周增生明顯,且同時(shí)段超聲輻照組較對(duì)照組內(nèi)膜增生程度輕(插Ⅱ圖 1)。電鏡下見增生的內(nèi)膜SMC多呈分泌型,富含粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體等,而肌絲成分較少,細(xì)胞間質(zhì)為大量膠原纖維和膠原原纖維,而中膜增厚較內(nèi)膜輕,其內(nèi)有較多的成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞。對(duì)照組SMC合成、分泌較旺盛。而反義核苷酸組及超聲輻照加反義核苷酸組可見SMC細(xì)胞核固縮、髓樣結(jié)構(gòu),胞質(zhì)中細(xì)胞器含量少等細(xì)胞“老化”趨勢。

2.2 圖像分析結(jié)果 超聲輻照組、反義核苷酸組、超聲輻照加反義核苷酸組與對(duì)照組比較,內(nèi)膜厚度顯著降低,分別減少35%、30%和55%(P＜0.01),見表2。

表2 各組內(nèi)膜、中膜厚度,內(nèi)/中膜厚度比值(±s,μ m,n=4)

表2 各組內(nèi)膜、中膜厚度,內(nèi)/中膜厚度比值(±s,μ m,n=4)

△:P＜0.01,與對(duì)照組比較;▲:P＜0.01,與反義核苷酸組比較。

組別 內(nèi)膜厚度 中膜厚度 內(nèi)/中膜厚度比值對(duì)照組 63±12 75±8 0.84±0.15超聲輻照組 41±6△ 64±7 0.64±0.10反義核苷酸組 44±5△ 68±10 0.65±0.05反義核苷酸加超聲輻照組 27±7△▲ 60±3 0.45±0.23

2.3 移植靜脈(增殖細(xì)胞核抗原,proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表達(dá) 見表3。

2.4 RT-PCR結(jié)果(圖2) 可見500～600 bp之間和300～400 bp之間分別有一條清晰的條帶,符合PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)的569 bp的 c-myc基因片段和310 bp的β-actin基因片段,3組(對(duì)照組、反義核苷酸組、超聲輻照加反義核苷酸組)β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物量相似,但反義核苷酸組,超聲輻照加反義核苷酸組明顯低于對(duì)照組,且超聲輻照加反義核苷酸組明顯低于反義核苷酸組。

2.5 基因表達(dá)結(jié)果 見表3。術(shù)后第 2周,與對(duì)照組比較,反義苷酸組基因表達(dá)減少了47%(P＜0.05),超聲輻照加反義核苷酸組減少74%(P＜0.01)。

圖2 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

表3 第4周PCNA陽性細(xì)胞數(shù)比較及免疫組織化學(xué)分析(±s,n=4)

表3 第4周PCNA陽性細(xì)胞數(shù)比較及免疫組織化學(xué)分析(±s,n=4)

△:P＜0.05,與對(duì)照組比較;▲:P＜0.05,與反義核苷酸組比較。

組別 PCNA陽性細(xì)胞數(shù) OD/x對(duì)照組 51.2±5.7 1.180±0.073超聲輻照組 15.1±2.6△ 0.783±0.156△反義核苷酸組 28.6±1.9△ 0.626±0.144△超聲輻照加反義核苷酸組 13.4±0.8△▲ 0.308±0.175△▲

3 討 論

自體靜脈作為移植材料的遠(yuǎn)期通暢率仍不理想,旁路移植術(shù)后失敗率約20%～50%[1-2],而冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)后10年僅有約60%仍通暢。與人工血管動(dòng)脈移植后再狹窄的原因相似[3],移植靜脈狹窄、閉塞的主要原因仍為內(nèi)膜增生導(dǎo)致,SMC由中膜向內(nèi)膜移行并大量增殖,伴有胞外基質(zhì)的分泌和沉積,是移植靜脈內(nèi)膜增生的核心病理生理機(jī)制[4]。近年來采用全身、局部藥物治療、基因治療、激光照射、血管內(nèi)放射等治療方法,但效果均不理想。張俊霞等[5]研究發(fā)現(xiàn),超聲輻照在無明顯殺傷細(xì)胞的情況下可以誘導(dǎo)SMC凋亡,阻止SMC S期DNA復(fù)制。本研究前期發(fā)現(xiàn),超聲輻照可以降低移植靜脈SMC的增殖,減輕內(nèi)膜的增生[6]。

血管SMC受到外界因素刺激后,細(xì)胞內(nèi)通過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用,啟動(dòng)細(xì)胞的內(nèi)調(diào)節(jié)增殖的基因表達(dá),其中原癌基因在啟動(dòng)細(xì)胞增殖過程中起著重要作用。C-myc原癌基因編碼一種短暫的,與核磷蛋白結(jié)合的特異DNA序列來調(diào)節(jié)DNA轉(zhuǎn)錄。起著啟動(dòng)和維持細(xì)胞增殖的雙重作用。轉(zhuǎn)染反義cmyc寡核苷酸進(jìn)入細(xì)胞,通過堿基互補(bǔ)的原則與靶RNA結(jié)合,形成DNA∶RNA雜交體,從而啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)RNA酶,迅速將mRNA降解,使mRNA的翻譯功能減弱或消失,不能產(chǎn)生有效的作用蛋白,由此來抑制靶基因的表達(dá),進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。有研究發(fā)現(xiàn),局部應(yīng)用生物蛋白膠和多聚凝膠攜載反義cmyc ODN,可以顯著抑制移植靜脈內(nèi)膜的增生。本研究中發(fā)現(xiàn),術(shù)后第4周反義c-myc組內(nèi)膜厚度較對(duì)照組降低了30%(P＜0.05)。

基因表達(dá)是由DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA,再經(jīng)修飾形成成熟的mRNA。成熟的mRNA經(jīng)翻譯表達(dá)相應(yīng)蛋白質(zhì)和多肽而發(fā)揮作用。因此,對(duì)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)mRNA表達(dá)水平的檢測,能了解該基因在細(xì)胞活動(dòng)中的作用是否活躍。RT-PCR是對(duì)細(xì)胞內(nèi)某一特定基因序列進(jìn)行大量擴(kuò)增后,檢測該基因mRNA在細(xì)胞中的表達(dá)水平,在實(shí)驗(yàn)條件控制一致時(shí),可半定量對(duì)比細(xì)胞mRNA含量的多寡,從而判斷細(xì)胞基因的表達(dá)水平。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,術(shù)后第2周,反義核苷酸組和反義核苷酸加超聲輻照c-myc基因表達(dá)與對(duì)照組比較,減少了47%和74%(P＜0.01),說明反義c-myc寡核苷酸能有效抑制c-myc靶基因的表達(dá),進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖和內(nèi)膜增厚。局部超聲輻照能促進(jìn)反義c-myc向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化,進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)c-myc基因表達(dá)的抑制作用,加之超聲本身對(duì)內(nèi)膜增生的抑制作用使內(nèi)膜增厚進(jìn)一步減輕。本研究中觀察到內(nèi)膜厚度減輕了55%(P＜0.01),說明局部應(yīng)用反義c-myc與超聲輻照的協(xié)同作用。

超聲輻照促進(jìn)外源基因轉(zhuǎn)化的機(jī)制尚不清楚,可能與細(xì)胞膜的通透性改變有關(guān)。在合理控制超聲輻照條件下,超聲既能使膜通透性增加,又不致使細(xì)胞明顯受損,而細(xì)胞膜通透性改變是基因轉(zhuǎn)化的前提。Wybex等[7]報(bào)道,20 kHz,20 w/cm2的超聲輻照30 s使質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母為對(duì)照的20倍。Miller等[8]應(yīng)用超聲1 M Hz,0.4 w/cm2輻照 60 s或 30 min,48 h后顯示,血管平滑肌細(xì)胞熒光素酶活力分別增加7.5倍和2.4倍。超聲通過機(jī)械作用和空化效應(yīng)聲也可影響細(xì)胞膜通透性。但主要源于空化效應(yīng),壓力波作用于細(xì)胞,仍是通過引起貫性空化(inertial caritation)而致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和(或)功能變化。kim等[9]和Bao等[10]證實(shí),空化效應(yīng)是影響細(xì)胞膜通透性的主要因素。用超聲行基因轉(zhuǎn)化和表達(dá),學(xué)者們的報(bào)道結(jié)果不盡相同。如連續(xù)波和非連續(xù)波的轉(zhuǎn)化率在不同報(bào)道中差異甚大。造成差異的原因除目的基因和受體細(xì)胞外,超聲系統(tǒng)及輻照條件也是重要影響因素。由于聲強(qiáng)表示方法和輻照劑量計(jì)量方法的多樣性,以及輻照過程中采用的透聲介質(zhì)、溶液組成、有無增強(qiáng)空化的因素存在等,給檢測結(jié)果比較帶來困難。Bao等[10]報(bào)道,輻照過程中旋轉(zhuǎn)試管與否轉(zhuǎn)化結(jié)果差異大,認(rèn)為旋轉(zhuǎn)有利于產(chǎn)生空化。既使細(xì)胞膜的通透性增加以利基因?qū)?又不致因超聲輻照而使細(xì)胞發(fā)生不可逆的損傷是達(dá)到滿意轉(zhuǎn)化率和表達(dá)率的前提。

本研究選擇的超聲參數(shù)源于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)探索的理想?yún)?shù),與Lawrie[11]等和Fitzgerald等[12]研究接近。但與Arakawa等[13]相差較大。由于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)存在組織對(duì)超聲能量的吸收,采用更高聲強(qiáng)、其他頻率和作用時(shí)間的超聲是否對(duì)內(nèi)膜增生抑制和基因轉(zhuǎn)化更有利還不清楚,有待進(jìn)一步探明。

[1] Bourassa MG.Fate of venous grafts:the past,the present and the future[J].J Am coll cadiol,1991,17(5):1081-1083.

[2] Veith FJ,Gupta SK,Ascer E,et al.Six-year prospective multicenter randamized comparison of autologous saphenous vein and expended polytetrafluoraethylene grafts in infrainguinal arterial reconstruction[J].J Vasc Surg,1986,3(1):104-114.

[3] 劉楊東,時(shí)德,彭真年,等.Cilostazol對(duì)犬股動(dòng)脈人工血管移植吻合處組織形態(tài)學(xué)影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].西南大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2011,33(4):99-103.

[4] 馬小干,時(shí)德.丹參對(duì)自體靜脈移植替代動(dòng)脈后早、中期通暢率及增殖病變的影響[J].中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志,2002,9(4):232-234.

[5] 張俊霞,黃晶,王新,等.超聲輻照對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2005,30(50):636-639.

[6] 劉楊東,趙渝,時(shí)德,等.超聲輻照對(duì)兔移植靜脈內(nèi)膜增生的影響[J].臨床超聲醫(yī)學(xué)雜志,2011,13(4):217-219.

[7] Wybex JA,Andrews J,D′Emanwele A.The use of sonication for the efficient delivery of plasmid DNA into cells[J].Pharm Res,1997,14(6):750-756.

[8] Miller MW,Milleo DL,Brayman AA.A review of in vitro bioeffects of inertial ultrasonic cavitation from a mechanistic perspective[J].Ultrasound Med Biol,1996,22(9):1131-1154.

[9] Kim HJ,Greenleaf JF,Kinnick RR,et al.Ultrasound-mediated transfection of mammalian cells[J].Hum Gene Ther,1996,7(11):1339-1346.

[10]Bao S,Thrall BD,Millex DL.Transfection of ureporter plasmid into cultured cells by sonoporation in vitro[J].Ultrasound M ed Biol,1997,23(6):953-959.

[11]Lawrie A,Brisken AF,Francisp SH,et al.Ultrasound enhances reporter gene expression after transfection of vascular cells in vitro[J].Circulation,1999,99(20):2617-2620.

[12]Fitzgerald PJ,Takagi A,Moore P,et al.Intravascular sonotherapy decrease neorntimal hyperplasia after stent implantation in swine[J]Circulation,2001,103(14):1828-1831.

[13]Arakawa K,Hagisawa K,Kusano H,et al.Sonodynamic therapy decrease.d neointimal hyperplasia after stenting in the rabbit iliao artery[J].Circulation,2002,105(2):149-151.