腎透明細胞癌miRNA-34a、Notch1和Hes1的表達及意義

楊 陽，崔蘇萍，婁遠蕾，謝 安，郭 菲，張明飛，汪 泱*

(1南昌大學研究生院醫(yī)學部，南昌330006;2南昌大學第一附屬醫(yī)院;3南昌大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科研究所;4南昌大學第一附屬醫(yī)院燒傷研究所)

研究表明，許多miRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉歸等有密切關系，在其中發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用［1，2］。Notch信號通路是進化上十分保守的信號通路，在細胞分化、增殖、凋亡、黏附、遷移及血管形成等方面都起到了十分重要作用，而異常的Notch信號途徑與許多腫瘤的發(fā)生有關。已有研究表明，miRNA-34a的靶基因為Notch1。目前Notch信號通路與腎癌的關系不明確，與Notch信號通路相關的miRNA在腎癌中的研究也未見報道。本實驗通過觀察比較miRNA-34a、Notch1和Hes1在腎透明細胞癌組織與癌旁正常組織的表達差異，探討其與腎癌發(fā)生發(fā)展的關系及可能的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2009年9月～2011年1月在南昌大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科行腎臟切除術患者的腎癌組織及其癌旁組織(規(guī)定距癌組織5cm以上)并保存于液氮中。取術后病理切片證明病理分型為腎透明細胞癌的病理組織共計48份。其中患者男31例、女17例，年齡21～75歲、平均52.5歲。手術方式:腎根治術41例(85.42%)，腎部分切除術7例(14.58%)。腫瘤按TNM(2002 AJCC)分期:Ⅰ期38例，Ⅱ期8例，Ⅲ期1例，Ⅳ期1例。按Fuhrman分級:1級24例，2級24例。腫瘤長徑1.5～9.5cm，平均 4.43cm。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 采用液氮研磨法將組織磨成粉末，加入Trizol按試劑說明書提取總RNA。

1.2.2 總RNA純度和濃度的檢測 使用超微量紫外分光光度計測定RNA濃度和純度，記錄OD260值。RNA純度檢測:RNA溶液的OD260/OD280的比值(比值范圍1.8～2.1為純度合格)。樣品RNA濃度計算公式為:OD260×40×稀釋倍數(ng/μl)。所提RNA －80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 逆轉錄 按Fermentas逆轉錄說明書操作。miRNA-34a用miRNA-34a莖環(huán)引物逆轉錄，其余用隨機引物逆轉錄。miRNA-34a莖環(huán)引物見表1。

表1 RT、PCR引物序列

1.2.4 實時熒光定量PCR 按試劑盒說明書操作，分別以U6和GAPDH為miRNA和mRNA的內參。引物由上海生工生物工程公司合成。引物序列及PCR產物片斷大小見表1。數據采用2－△△CT法進行分析。變化倍數大于2為高表達，小于0.5為低表達，兩者之間為無差別。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，數據用±s表示，比較采用配對樣本t檢驗和兩樣本t檢驗，各指標間關系采用Spearman等級相關分析。P≤0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 腎癌組織及癌旁正常組織中 miRNA-34a、Notch1、Hes1的表達 48份標本中有33份腎癌標本miRNA-34a高表達，8例低表達，7例無差別;36份腎癌標本Notch1低表達，3例高表達，9例無差別;31份腎癌標本Hes1低表達，9例高表達，8例無差別。與癌旁正常腎組織相比，腎癌組織miRNA-34a、Notch1、Hes1 總的表達變化倍數分別為 4.093±3.661、0.497±0.724、0.498±0.872，均有統(tǒng)計學差異(P ＜0.05)。

2.2 miRNA-34a、Notch1、Hes1 的表達與腎癌臨床病理參數間的關系 見表2。

2.3 腎癌組織中miRNA-34a與Notch1、Hes1的相關性 Spearman相關分析顯示，腎癌組織中miRNA-34a與 Notch1、Hes1之間呈負相關(rs分別為－0.427、－0.549，P 均 ＜0.05)，Notch1 和 Hes1 之間呈正相關(rs=0.540，P ＜0.05)。

表2 miRNA-34a、Notch1、Hes1的表達與臨床病理參數間的關系

3 討論

miRNA-34a是抑癌基因p53的一個靶基因，作為抑癌基因的miRNA-34a除了協(xié)同p53促進細胞凋亡外，還通過調控 cyclinE、CDK4、E2F1和 E2F3蛋白表達水平參與調控細胞周期的G1阻滯［3］。已有研究表明，miRNA-34a在不同的腫瘤中有不同的表達情況。在惡性膠質瘤中，miRNA-34a是低表達的，通過靶基因C-met、Notch1和Notch2抑制大腦腫瘤生長，作為抑癌基因的miRNA-34a在神經母細胞瘤中也是低表達的。Dutta等［4］證實，miRNA-34a在氧化應激誘導的大鼠腎癌、宮頸癌的細胞系hela細胞和乳腺癌的mcf-7細胞中表達均明顯升高，并證實miRNA-34a能促進腫瘤細胞的增殖。對miRNA-34a進行基因敲除后，腎癌細胞的增殖被抑制，從而表明miRNA-34a的過度表達在腎癌的發(fā)生過程中起到了重要作用。本研究48份標本中有33份腎癌標本miRNA-34a高表達。與已報道［5］的腎癌組織芯片結果相一致，提示miRNA-34a在腎透明細胞癌中作為癌基因起作用。

Notch信號通路由 Notch受體、Notch配體和DNA結合蛋白組成。當Notch受體和相鄰細胞的配體結合后，Notch被蛋白酶兩次切割，釋放出具有核定位信號的胞內區(qū)，后者進入細胞核與DNA結合蛋白結合，調節(jié)靶基因表達，進而調控細胞的生長和分化等。越來越多的證據表明，異常的Notch信號與一些人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關，但在不同腫瘤細胞中的具體表現(xiàn)又有明顯不同。Notch信號途徑在腫瘤細胞中具有雙重特性，起癌基因或抑癌基因作用，如結腸癌、腦腫瘤、乳腺癌等人類實體瘤中均發(fā)現(xiàn)Notch1蛋白高表達起癌基因作用。而Hanlon等［6］則提出在胰腺導管腺癌模型中，Notch1作為抑癌作用促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前Notch信號與腎癌的關系尚不十分明確，Sjulund等在腎癌細胞株中測得Notch通路各組成蛋白存在并且高表達;Notch1和Hes1在腎透明細胞癌組織中的表達高于在正常腎組織中的表達。Sun等研究結果表明，與其相應的癌旁組織相比，Notch1在腎癌組織中低表達，且與臨床分期有關。Hes1是堿式螺旋—環(huán)—螺旋轉錄因子家族的成員。作為Notch信號通路的下游基因之一，受Notch信號的正調控，其表達與Notch1表達相一致。本研究結果表明，Notch1、Hes1表達都是下調的，并且兩者呈正相關。

Pang等研究證實 miRNA-34a的靶基因是Notch1和jag-1。通過轉染證實，miRNA-34a對細胞的增殖無影響，但可通過下調靶基因Notch1和jag-1抑制細胞的侵襲。而Li等研究表明miRNA-34a通過靶基因C-met、Notch1和 Notch2可促進惡性膠質瘤的細胞增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-34a隨著腎癌病理分級的增高而增高，Notch1的表達則隨著腎癌病理分級的增高而降低;而且Hes1在腎癌組織中也是低表達;提示Notch信號通路可能經由高表達的miRNA-34a下調其靶基因Notch1參與腎透明細胞癌的發(fā)生發(fā)展。高表達的miRNA-34a有望成為腎癌診斷的分子標志物及潛在的治療靶點。本研究還發(fā)現(xiàn)，miRNA-34a和Notch1的表達水平與年齡有關，因干擾因素太多，其具體的作用機制及可能的意義有待進一步研究。

［1］Liu J，Valencia-Sanchez MA，Hannon GJ，et al.MicroRNA dependent localization of targeted mRNAs to mammaliam P-bodies［J］.Nat Cell Biol，2005，7(7):719-723.

［2］Zhang B，Pan X，Cobb GP，et al.MicroRNAs as oncogenes and tumor suppressors［J］.Dev Biol，2007，302(1):1-12.

［3］He L，He XY，Lim LP，et al.A microRNA component of the p53 tumour suppressor network［J］.Nature，2007，447(7148):1130-1134.

［4］Dutta KK，zhong Y，Liu YT，et al.Association of microRNA-34a overexpression with proliferation is cell typer-dependent［J］.Cancer Sci，2007，98(12):1845-1852.

［5］Juan D，Alexe G，Antes T，et al.Identification of a MicroRNA panel for clear-cell kidney cancer［J］.Urology，2010，75(4):835-841.

［6］Hanlon L，Avila JL，Demarest RM，et al.Notchl functions as a tumor suppressor in a model of K-ras-induced pancreatic ductal adenocarcinoma［J］.Cancer Res，2010，70(11):4280-4286.