地塞米松誘導(dǎo)的危重病性肌病大鼠的TGF-β/Smad表達(dá)

袁 靜，梁 佳，趙 頌，包翠芬*

(1遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121001;2遼寧醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心)

危重病性肌病(CIM)是危重患者肌無(wú)力和肌麻痹引起的急性原發(fā)性肌病，以骨骼肌本身或神經(jīng)—肌肉接頭間傳遞障礙為特征，主要病理變化為肌肉萎縮和壞死［1，2］。目前，CIM 的發(fā)病機(jī)制尚未明了。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)/Smad通路在調(diào)節(jié)肌細(xì)胞(尤其是骨骼肌細(xì)胞)的生長(zhǎng)、分化中起重要作用。為探討TGF-β通路在CIM發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能的調(diào)控機(jī)制，2009～2011年，我們進(jìn)行了相關(guān)研究?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1．1 動(dòng)物、儀器及試劑 健康雌性SD大鼠40只，體質(zhì)量180～210 g，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。全自動(dòng)免疫組化染色儀(美國(guó)DAKO公司);CIAS-1000型細(xì)胞圖像分析儀(北京大恒公司);Carl Zeiss A1顯微鏡(德國(guó)公司);PowerPac 3000電泳儀、Trans-blot SD半干轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

地塞米松(SIGMA公司);兔抗大鼠TGF-β1、Smad3單克隆抗體(博奧森公司);細(xì)胞裂解液、蛋白質(zhì)預(yù)染marker(Beyond公司)。

1．2 方法

1．2．1 CIM模型制備及鑒定 將大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組10只、觀(guān)察組30只;觀(guān)察組又分為7、9、11 d三個(gè)亞組各10只。觀(guān)察組用地塞米松5 mg/kg腹腔注射，對(duì)照組用等量生理鹽水腹腔注射，均每日1次。按照Lennon等提出的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定肌功能缺損程度。每天觀(guān)察并記錄各組肌功能缺損癥狀，不符合條件者剔除，并按嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行補(bǔ)充、分組。

1．2．2 組織標(biāo)本制備 各組均用4%多聚甲醛經(jīng)腹主動(dòng)脈灌注固定，然后剖開(kāi)左側(cè)肢體，分別在垂直于比目魚(yú)肌長(zhǎng)軸方向處切取長(zhǎng)約1 cm肌肉組織。繼續(xù)用4%多聚甲醛固定約12 h，然后行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、常規(guī)石蠟包埋，切片厚度5 μm。

1．2．3 免疫組化標(biāo)本制備及檢測(cè) 取上述切片行常規(guī)脫蠟至水，用3%過(guò)氧化氫液處理30 min，去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;采用高壓修復(fù)抗原，按順序滴加適當(dāng)稀釋的一抗、二抗及SP復(fù)合物;分別行DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、中性樹(shù)膠封片，在光鏡下觀(guān)察TGF-β1、Smad3陽(yáng)性表達(dá)情況。陰性對(duì)照用PBS替代一抗。采用CIAS-1000型細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)，統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野下TGF-β1、Smad3陽(yáng)性表達(dá)的平均灰度。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS10．0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)用±s表示，多組間比較用單因素方差分析。P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 各組肌功能缺損情況 對(duì)照組全部存活，無(wú)肌功能缺損癥狀;觀(guān)察組死亡8只，其中觀(guān)察7 d組出現(xiàn)肌肉功能缺損癥狀7只，觀(guān)察9、11 d組均出現(xiàn)肌功能缺損癥狀，以觀(guān)察11 d組肌功能缺損程度最重。

2．2 各組肌功能缺損評(píng)分及 TGF-β1、Smad3陽(yáng)性表達(dá) 見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠肌功能缺損評(píng)分及TGF-β1、Smad3陽(yáng)性表達(dá)比較(ˉx ± s)

3 討論

TGF-β是具有多種生物活性的多肽類(lèi)細(xì)胞因子，在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，與炎癥、纖維化、腫瘤等密切相關(guān)。Smads作為T(mén)GF-β的下游信號(hào)分子，是將TGF-β信號(hào)從細(xì)胞外轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)的關(guān)鍵因子［3］。TGF-β在細(xì)胞外與TβRⅢ形成復(fù)合物后被傳遞給經(jīng)磷酸化的TβRⅡ或直接與其結(jié)合，形成二元復(fù)合物，進(jìn)而激活TβRⅠ，形成三元/二元復(fù)合物，在靶細(xì)胞內(nèi)與膜受體偶聯(lián)的GS區(qū)形成信號(hào)復(fù)合物，活化Smad2/3的MH2結(jié)構(gòu)域，進(jìn)而與Smad4形成異源寡聚體復(fù)合物，隨后轉(zhuǎn)移到胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄效應(yīng)。

研究表明，TGF-β/Smad通路通過(guò)調(diào)控成肌調(diào)節(jié)因子影響肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖與分化，從而抑制骨骼肌特異基因表達(dá)［4］。近年研究顯示，衰老可引起骨骼肌萎縮，TGF-β/Smad信號(hào)通路激活是導(dǎo)致肌衛(wèi)星細(xì)胞喪失增殖修復(fù)能力的重要原因，抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路可使衰老的骨骼肌恢復(fù)再生能力［5］。Hirose等［6］在尾部懸吊或去神經(jīng)誘導(dǎo)的肌萎縮大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，TGF-β及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體TβRII/TβRI和介導(dǎo)子Smad均出現(xiàn)不同程度的高表達(dá)。目前，由地塞米松誘導(dǎo)的CIM大鼠的TGF-β/Smad通路如何發(fā)揮作用尚無(wú)報(bào)道。我們?cè)^(guān)察大鼠腹腔注射地塞米松5 mg/kg后的肌功能缺損情況，注射7 d時(shí)其出現(xiàn)肌功能缺損癥狀，光鏡下可見(jiàn)不同程度的肌細(xì)胞萎縮;13 d時(shí)10只大鼠分別于12、13 d死亡。本研究顯示，觀(guān)察組死亡率為26．6%(8/30);觀(guān)察7 d時(shí) 70．0%(7/10)出現(xiàn)肌功能缺損癥狀，9、11 d時(shí)均出現(xiàn)明顯肌功能缺損癥狀，且其TGF-β1、Smad3陽(yáng)性表達(dá)明顯升高，以觀(guān)察11 d時(shí)最明顯。提示地塞米松誘導(dǎo)的 CIM大鼠隨病程延長(zhǎng)，其 TGF-β1、Smad3表達(dá)升高。

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