紫貽貝酶解多肽體外抗腫瘤活性研究

楊永芳，丁國(guó)芳，楊最素，郁 迪，鄭玉寅，李 榮

（浙江海洋學(xué)院食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江舟山 316004）

紫貽貝Mytilus edulis隸屬于軟體動(dòng)物門、雙殼綱、貽貝目、貽貝科，盛產(chǎn)于我國(guó)渤海、黃海等海域，在我國(guó)北方稱海紅，江浙一帶稱淡菜，是我國(guó)主要的養(yǎng)殖貝類，在浙江省嵊泗縣，養(yǎng)殖和加工紫貽貝已成為該地居民的主要經(jīng)濟(jì)來(lái)源，而紫貽貝的價(jià)格一直以來(lái)非常低廉。當(dāng)前，貽貝的醫(yī)療保健作用已得到了普遍的認(rèn)同，據(jù)《本草匯言》載，“淡菜，補(bǔ)虛養(yǎng)腎之藥也”?，F(xiàn)代研究表明，貽貝提取物有抗腫瘤、抗衰老、抗病毒和抗菌等功能，具有增加機(jī)體免疫能力、降低血脂含量的功效[1-5]。

活性多肽由于具有敏感性高、穩(wěn)定性好及副作用少等優(yōu)點(diǎn)，已被用作抗腫瘤藥物開發(fā)的一個(gè)重要來(lái)源。研究已經(jīng)證實(shí)，食物蛋白通過(guò)蛋白酶酶解方式，可以得到功能多樣的活性多肽[6-11]，由于貽貝來(lái)源非常豐富，而其所具有抗腫瘤活性功能也已得到證實(shí)。在此基礎(chǔ)上，本研究通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定胰蛋白酶水解貽貝的最佳酶解條件，并研究酶解多肽的體外抗腫瘤活性，以期為該領(lǐng)域的進(jìn)一步研究提供科學(xué)依據(jù)，并且對(duì)于進(jìn)一步研究與開發(fā)以貽貝酶解多肽為基礎(chǔ)的功能性食品和藥物，提高貽貝的經(jīng)濟(jì)價(jià)值具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

紫貽貝購(gòu)自浙江省舟山市南珍市場(chǎng)（經(jīng)浙江海洋學(xué)院趙盛龍教授鑒定）；胰蛋白酶購(gòu)自北京亞太恒信生物科技有限公司；F12和MTT均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自美國(guó)AMRESCO公司；一抗Bcl-2和SABC試劑盒均購(gòu)自武漢博士德公司；其余試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

德國(guó)Sartorius AG公司BSA124S型電子天平；上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠SSW型微電腦電熱恒溫槽；上海標(biāo)本模型廠DS-1型高速組織搗碎機(jī)；日本HITACHI公司CF16RXII高速冷凍離心機(jī)；上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司ZHJH-C1209C型超凈工作臺(tái)；美國(guó)Thermo公司Forma 3111型CO2培養(yǎng)箱；日本OLYMPUS公司倒置顯微鏡；美國(guó)Bio-Rad公司酶標(biāo)儀。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酶解條件優(yōu)化

選用胰蛋白酶，考慮到A（料液比）、B（pH）、C（加酶量）、D（溫度）和 E（時(shí)間）5個(gè)因素，每個(gè)因素選4個(gè)水平進(jìn)行L16(45)的正交實(shí)驗(yàn)，比較在不同水解條件下的酶解液的水解度和抗腫瘤活性，從而確定最佳酶種及其水解條件。水解工藝如下：

1.3.2 甲醛滴定法測(cè)定AAN

參照趙新淮等[12]方法并稍作修改。取20 mL酶解溶液置于燒杯中，加水60 mL，開動(dòng)磁力攪拌器，用0.05 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液滴定至pH為8.2。加入10 mL甲醛溶液混勻，再用0.05 mol/L氫氧化鈉溶液繼續(xù)滴定至pH為9.2，記下消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)的毫升數(shù)，同時(shí)取水80 mL做試劑空白試驗(yàn)。按下列公式計(jì)算AAN含量，AAN含量與水解度成正相關(guān)。

式中，X為樣品中氨基氮的含量（g/100 mL）；V1為測(cè)定用樣品加入甲醛稀釋后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液（mL）；V2為試劑空白試驗(yàn)加入甲醛后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（mL）；V為樣品液取用量（mL）；C為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液的濃度（mol/L）；0.014為氮的毫摩爾質(zhì)量（g/mmoL）。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)

選取人前列腺癌細(xì)胞DU-145和PC-3細(xì)胞（原購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存）、肺癌細(xì)胞H1299和胃癌細(xì)胞MGC80-3，分別用含10%胎牛血清的F12（DU-145和PC-3）和RM1640（H1299和MGC80-3）培養(yǎng)基于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.3.4 細(xì)胞增殖抑制率的測(cè)定

采用MTT法進(jìn)行檢測(cè)，參照LIN等[13]的方法稍作修改。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成懸液，接種至96孔板，每孔200 μL，于5%CO2，37℃貼壁24 h，然后分別加入不同濃度的酶解多肽溶液，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行孔，同時(shí)設(shè)加PBS的對(duì)照組，置5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中孵育，培養(yǎng)結(jié)束后，加PBS洗2遍，然后加MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄MTT，加DMSO充分震蕩后置酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm測(cè)吸光度，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率（IR），按下列公式計(jì)算。

1.3.5 細(xì)胞形態(tài)觀察

采用HE染色方法。將DU-145和PC-3細(xì)胞接種在帶有蓋玻片的6孔板上，細(xì)胞爬片24 h后，分別加入濃度為1.5 mg/mL的酶解多肽，培養(yǎng)24 h和48 h后，將蓋玻片取出，95%酒精固定15 min。PBS洗2次，蘇木素進(jìn)行染色，自來(lái)水充分水洗，伊紅復(fù)染，自來(lái)水浸洗，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并攝片。

1.3.6 細(xì)胞中Bcl-2基因表達(dá)測(cè)定

采用免疫組化方法。一抗為兔抗人Bcl-2抗體。細(xì)胞爬片及樣品作用后的蓋玻片經(jīng)丙酮固定，雙氧水∶甲醇（1∶50）滅酶后備用。抗Bcl-2的工作濃度均為1：50，生物素化單抗和SABC試劑的工作濃度均為1∶100。實(shí)驗(yàn)過(guò)程參照SABC說(shuō)明書進(jìn)行，其中以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶及酶解條件的確定

正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)及正交試驗(yàn)結(jié)果見表1，方差分析見表2。

表1 胰蛋白酶對(duì)紫貽貝酶解工藝條件的正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Trypsin orthogonal design and result

表2 方差分析結(jié)果Tab.2 The results of variance analysis

從表1、表2可以看出，在5個(gè)因素中，以加酶量對(duì)肽鍵生成量的影響最大，具有顯著性差異（P＜0.05），各因子對(duì)肽鍵含量的影響依次為加酶量＞溫度＞料液比＞時(shí)間＞pH，以此為指標(biāo)確定的最佳酶解工藝為A3B4C2D3E4，即料液比為1：4、pH為8.5、加酶量為1 000 U/g、溫度為45℃、酶解時(shí)間為5 h。另一方面，以IR為指標(biāo)，酶解溫度對(duì)其影響最大且具有顯著性差異（P＜0.05），各因子對(duì)肽鍵含量的影響依次為溫度＞加酶量＞pH＞料液比＞時(shí)間，最佳酶解工藝為A3B3C3D2E1。由于本實(shí)驗(yàn)最終目的是得到抗腫瘤活性較強(qiáng)的酶解液，所以，本實(shí)驗(yàn)取A3B3C3D2E1，即料液比為1：4、pH為8.0、加酶量為1 500 U/g、溫度為40℃、酶解時(shí)間為2 h作為酶解條件，得到的酶解物作為下一步實(shí)驗(yàn)用樣品。

2.2 紫貽貝酶解多肽的抗腫瘤活性

采用MTT法檢測(cè)上述水解條件下得到的酶解多肽對(duì)DU-145、PC-3、H1299和MGC80-3作用24 h后的增殖抑制率，結(jié)果見表3。紫貽貝酶解多肽對(duì)DU-145細(xì)胞的增殖抑制率最大，當(dāng)濃度為5 mg/mL時(shí)，抑制率為50.23%；對(duì)PC-3細(xì)胞抑制活性較差，濃度為5 mg/mL時(shí)，抑制率僅為43.17%；對(duì)H1299和MGC80-3細(xì)胞幾乎沒(méi)有活性；此外，酶解多肽對(duì)DU-145和PC-3的抑制活性呈現(xiàn)濃度依賴性，而當(dāng)酶解多肽的濃度為0.5 mg/mL時(shí)，對(duì)4種細(xì)胞均沒(méi)有顯著的增殖抑制效果。

表3 不同濃度酶解多肽對(duì)4種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率Tab.3 Effect of peptide on proliferation of four kinds of cell lines

2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

HE染色結(jié)果顯示（圖1、圖2），圖中A為正常的前列腺癌細(xì)胞，B為酶解多肽作用24 h后的細(xì)胞形態(tài)，C為酶解多肽作用48 h后的細(xì)胞形態(tài)。由圖1、圖2可以看出，正常細(xì)胞胞質(zhì)染色均一，細(xì)胞分裂明顯，形態(tài)飽滿，細(xì)胞核大小不一，核仁數(shù)目多。1.5 mg/mL的酶解多肽作用24 h后，細(xì)胞質(zhì)濃縮，胞核開始固縮變小，胞間隙增大部分細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)空泡，有凋亡小體形成。作用48 h后，上述改變加劇，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，胞間隙加大明顯，細(xì)胞輪廓模糊，細(xì)胞核固縮，破碎，染色質(zhì)顏色加深。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察顯示，酶解多肽可以明顯改變2種腫瘤細(xì)胞的骨架結(jié)構(gòu)，并且對(duì)DU-145和PC-3細(xì)胞的活性作用強(qiáng)度具有時(shí)效關(guān)系。

圖1 DU-145細(xì)胞的HE染色（×400）Fig.1 HE staining of DU-145 cells(×400)

圖2 PC-3細(xì)胞的HE染色（×400）Fig.2 HE staining of PC-3 cells(×400)

2.4 細(xì)胞Bcl-2表達(dá)測(cè)定

Bcl-2在前列腺癌細(xì)胞中通常過(guò)量表達(dá)，一般其陽(yáng)性染色主要定位于胞漿，根據(jù)陽(yáng)性率不同表現(xiàn)為淺黃、黃色和黃棕色（圖3、圖4），圖中A為一抗為PBS的陰性對(duì)照組，B為樣品加入前Bcl-2的陽(yáng)性表達(dá)，C為樣品加入48h后Bcl-2的陽(yáng)性表達(dá)。由圖3、圖4可知，樣品加入前，DU-145和PC-3細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)量均呈陽(yáng)性表達(dá)，呈黃棕色；酶解多肽作用后，DU-145和PC-3細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)量均明顯下降，呈淺黃色。

圖3 Bcl-2在DU-145細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)（×400）Fig.3 The expression level of Bcl-2 in DU-145 cells（×400）

圖4 Bcl-2在PC-3細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)（×400）Fig.4 The expression level of Bcl-2 in PC-3 cells（×400）

3 討論

本文首先采用正交實(shí)驗(yàn)方法，以紫貽貝為材料，水解度和腫瘤細(xì)胞增殖抑制率為指標(biāo)，考察了各因素及水平對(duì)胰蛋白酶水解的影響。結(jié)果顯示，在本實(shí)驗(yàn)所選用的5個(gè)因素中，對(duì)酶解物的水解度和抗腫瘤活性影響最大的因素不同；當(dāng)酶解物的水解度和抗腫瘤活性最大時(shí)，各因素的水平也不相同。以上結(jié)果表明，酶解物的水解度與抗腫瘤活性之間沒(méi)有正反相關(guān)性，抗腫瘤活性的大小只與酶解物的組成成份相關(guān)，這與先前GUO等[14]的研究結(jié)果相似。由于因素中各水平的輕微變化會(huì)最終改變酶解物的活性功能，因此，在生產(chǎn)目標(biāo)肽的水解過(guò)程中，應(yīng)嚴(yán)格控制生產(chǎn)條件，以保證目的肽的獲得及實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。其次，本實(shí)驗(yàn)研究了最佳水解條件下得到的酶解多肽對(duì)4種腫瘤細(xì)胞的增殖抑制活性，結(jié)果表明，該肽只對(duì)前列腺癌細(xì)胞系的DU-145和PC-3表現(xiàn)出了強(qiáng)的活性，而對(duì)胃癌，肺癌等腫瘤細(xì)胞沒(méi)有顯著活性。據(jù)此推測(cè)，本研究所得的多肽對(duì)前列腺癌具有特異性抑制作用，可能是通過(guò)作用于其特異性基因而達(dá)到抑制效果的，而HE染色顯示，多肽作用后的2種腫瘤細(xì)胞均出現(xiàn)明顯的凋亡小體，多肽對(duì)2種細(xì)胞的作用機(jī)制之一可能是通過(guò)凋亡途徑實(shí)現(xiàn)。

Bcl-2是目前公認(rèn)的抗凋亡基因，在細(xì)胞周期中起到維持細(xì)胞增殖與凋亡相互平衡的作用，研究證明[15]，Bcl-2的過(guò)量表達(dá)與前列腺癌的發(fā)生有關(guān)，并且它可與Bax、FasL和Fas等基因協(xié)同作用，參與了前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展。另有研究表明[16]，Bcl-2的高表達(dá)與激素依賴性前列腺癌向激素非依賴性前列腺癌的轉(zhuǎn)化以及前列腺癌治療過(guò)程中出現(xiàn)的抵制現(xiàn)象具有十分密切的關(guān)系。因此，抑制Bcl-2的表達(dá)，不但可以有效控制前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，還可以提高前列腺癌治療效果。本研究得到的紫貽貝酶解多肽，可以顯著地降低Bcl-2的表達(dá)，誘導(dǎo)DU-145和PC-3凋亡，因此，可將此肽作為抗前列腺癌藥物或輔助藥物進(jìn)行開發(fā)。但是，本研究中多肽在低濃度時(shí)幾乎沒(méi)有活性，在高濃度時(shí)才顯示出顯著活性，這可能是由于樣品中含有過(guò)多的無(wú)活性雜質(zhì)導(dǎo)致的，所以，為了提高其活性效果，降低作用濃度，進(jìn)一步的分離純化也是十分必要的。

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