三種殺菌劑對(duì)黃瓜內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性的影響

方素云, 王振中

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理生理學(xué)研究室,廣州 510642)

植物內(nèi)生菌是一個(gè)多樣性十分豐富的微生物類群,分布于健康植物組織內(nèi),并與寄主植物協(xié)同進(jìn)化[1]。其生長代謝受多方面因素制約,不僅受到寄主植物的影響,外界環(huán)境因子(如季節(jié)溫度變化、光照、雨水、空氣濕度)也是其重要影響因素[2-3]。外界環(huán)境變化影響植物生長代謝,間接影響到內(nèi)生菌生物多樣性與生長代謝。還有一些化學(xué)物質(zhì)并不影響植物的生長代謝,但卻直接影響內(nèi)生菌的數(shù)量和多樣性,如一些人工合成的殺蟲劑、殺菌劑等[4-5]。

末端限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)(terminal restriction fragment length polymorphism,TRFLP),是建立在 PCR的基礎(chǔ)上,通過分析微生物群落16S rRNA基因的限制性酶切片段(terminal restriction fragments,T-RFs)的多態(tài)性來反映微生物群落多樣性及其定量關(guān)系的基因指紋技術(shù),不需要微生物的分離、純培養(yǎng),因而避免了培養(yǎng)方法的弊端,相對(duì)于其他分子生物學(xué)技術(shù),它具有分辨率高、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化及互聯(lián)網(wǎng)海量數(shù)據(jù)庫共享等優(yōu)勢(shì)。1997年以來的大量研究實(shí)踐表明,T-RFLP技術(shù)是分析復(fù)雜微生物群落的最強(qiáng)有力的工具之一[6-9]。

殺菌劑在現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用,但大量施用對(duì)植物的內(nèi)生微生物的影響是非常直接的。Babich等[10]提出,一種化學(xué)污染物對(duì)某一生態(tài)系統(tǒng)中微生物的影響,可以間接反映出該種化學(xué)品對(duì)此生態(tài)系統(tǒng)的影響。Seghers等[5]研究結(jié)果表明農(nóng)用化學(xué)品不僅會(huì)對(duì)土壤微生物群落產(chǎn)生影響,而且還會(huì)對(duì)根內(nèi)生菌群落產(chǎn)生影響。利用生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)來進(jìn)行農(nóng)藥污染物的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)正在被廣泛應(yīng)用[11-12]。農(nóng)用鏈霉素、苯醚甲環(huán)唑、代森鋅是生產(chǎn)上常用的殺菌劑,在植物病害防治方面發(fā)揮了重要的作用。但是,其應(yīng)用后對(duì)植物內(nèi)生細(xì)菌影響的研究在國內(nèi)外鮮有報(bào)道。

本試驗(yàn)利用T-RFLP技術(shù),研究3種殺菌劑處理黃瓜后對(duì)其根、莖、葉的內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性的影響。以此了解殺菌劑使用后對(duì)植物內(nèi)生細(xì)菌生態(tài)系統(tǒng)平衡的可能性影響,為殺菌劑進(jìn)一步合理安全使用提供理論依據(jù),具有較大的理論與實(shí)踐意義,為評(píng)價(jià)殺菌劑施用后對(duì)植物內(nèi)生細(xì)菌資源的影響提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植物：黃瓜(CucuMis sativus Linn.)品種為‘華優(yōu)一號(hào)’(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)科技實(shí)業(yè)發(fā)展總公司)。

供試藥劑：農(nóng)用鏈霉素72%可溶性粉劑(青島恒瑞高科技農(nóng)化有限公司),苯醚甲環(huán)唑10%水分散粒劑(先正達(dá)投資有限公司),代森鋅65%可濕性粉劑(青島海澳生化有限公司)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

盆栽黃瓜,6片真葉時(shí),用殺菌劑藥液噴霧處理,處理1為72%農(nóng)用鏈霉素可溶性粉劑,噴施濃度為150mg/L。處理2為10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑2 500倍液,處理3為65%代森鋅可濕性粉劑1 200倍液,對(duì)照為不施藥處理,噴灑清水,分別于施藥后 0、1 、3 、5、7、14、21 d 采集不同處理的根 、莖、葉樣本,放入-70℃冰箱備用。每組處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3 黃瓜線粒體和葉綠體的排除

用非熒光標(biāo)記的引物8 f,518 r擴(kuò)增黃瓜根部基因組 DNA,擴(kuò)增產(chǎn)物用試劑盒(TIANGEN)純化,然后連接到PMD19-T載體(TaKaRa)上,再轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,通過藍(lán)白斑篩選陽性克隆,并用RV-M和MB-47作為引物的菌落PCR的方法檢查插入片段的大小,如果片段大小為700 bp左右(擴(kuò)增片段除了包含530 bp左右的16S rDNA序列,還包括兩端載體上的序列共156 bp),則鑒定為陽性克隆。將插入正確片段的陽性克隆菌液進(jìn)行測(cè)序(華大基因科技股份有限公司),以插入正確片段的陽性克隆為模板,再用熒光引物8 f和518 r進(jìn)行PCR反應(yīng),對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行酶切電泳分析和T-RFLP測(cè)序(上?；瞪锛夹g(shù)有限公司)。

1.4 T-RFLP分析

1.4.1 DNA提取

用無菌水徹底清洗黃瓜的根莖葉表面,然后依次用70%乙醇浸泡30 s,2.6%次氯酸鈉浸泡3min,無菌水沖洗5次,無菌濾紙吸取多余水分。將最后一次清洗的水少量涂布于NA平板,以檢查表面滅菌的效果。采用改進(jìn)的CTAB法分別提取黃瓜根莖葉基因組DNA[13],置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 細(xì)菌16S rDNA片段的PCR擴(kuò)增和純化

將提取的基因組DNA作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的模板,采用通用引物擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA。

正向 引物 為 8 f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;

反向引物為 518 r：5′-A TTACCGCGGCTGCTGG-3′[14]。

其中正向引物 5′端用6-羧基二乙酸熒光素(FAM)標(biāo)記。引物由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成并標(biāo)記。

PCR反應(yīng)體系總體積為50μL,內(nèi)含Taq DNA聚合酶緩沖液5μL,MgCl2 2.5 mmol/L,dNTPs(each)0.25 mmo l/L,正向和反向引物各0.4μMol/L,模板40 ng,Taq DNA聚合酶(TaKaRa)5 U。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min,95℃變性45 s,52℃復(fù)性45 s,72℃延伸1.5 min,35個(gè)循環(huán),72℃最終延伸10 min。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用PCR純化試劑盒(TIANGEN)純化,方法按說明進(jìn)行。

1.4.3 酶切分析

純化后的PCR產(chǎn)物用內(nèi)切酶 HeaⅢ消化,20μL中反應(yīng)體系包含10×MBuffer 2μL。DNA 200 ng,HeaⅢ1μL,加入滅菌雙蒸水至20μL,37℃消化6 h,然后65℃溫育20min將酶滅活。酶切產(chǎn)物的T-RFLP分析由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司完成。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Peak Scanner Software v1.0軟件將測(cè)序結(jié)果與DNA片段長度標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)比,從而確定每個(gè)T-RF的長度和豐度,有效 T-RFs片段數(shù)目可以用來確定樣品中微生物種群數(shù),每個(gè) T-RFs所對(duì)應(yīng)峰的面積反映了該種群的豐度,而每個(gè)不同長度TRFs的峰面積在所有 T-RFs的峰面積總和中的比例可以反映這個(gè)片段在酶切片產(chǎn)物中的相對(duì)豐度即優(yōu)勢(shì)度,從而間接反映出這個(gè)片段所代表的物種在微生物群落中的相對(duì)豐度[15-16]。最后使用基于互聯(lián)網(wǎng)的微生物群落分析工具Phy logenetic Assignment Tool以確定與其相匹配的微生物種類。微生物多樣性指數(shù)采用 Shannon-Weiner指數(shù)(H)法計(jì)算[17],其計(jì)算公式為：H=-∑Pi ln P i,其中 Pi表示每個(gè)峰面積占總面積的比率。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜線粒體和葉綠體的排除

由于植物葉綠體16S rDNA和線粒體18S rDNA與細(xì)菌的16S rDNA高度同源,因此在以非培養(yǎng)方法研究植物內(nèi)生細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)時(shí),要排除植物葉綠體16S rDNA和線粒體18S rDNA的干擾是非常重要的。本文采用克隆的方法,得到黃瓜葉綠體DNA和線粒體DNA的陽性克隆,通過測(cè)序得到葉綠體16S rDNA和線粒體18S rDNA的T-RF片段大小分別為295 bp和189 bp(圖1)。這兩個(gè)片段在T-RFLP的分析中將被排除。

圖1 黃瓜線粒體和葉綠體克隆的T-RFLP圖譜

2.2 T-RFLP分析

2.2.1 黃瓜葉、莖、根不同時(shí)間內(nèi)生細(xì)菌的 H值變化情況

經(jīng)3種不同殺菌劑處理后,黃瓜葉片中不同時(shí)間內(nèi)生細(xì)菌的H值變化如圖2。結(jié)果表明,經(jīng)3種殺菌劑處理后的樣品 H值明顯低于對(duì)照,總體趨勢(shì)為先降后升。代森鋅處理1 d后,H值較空白對(duì)照變化最大,減少了43.7%,農(nóng)用鏈霉素,苯醚甲環(huán)唑處理5 d后,樣品的 H值較空白對(duì)照分別減少69.4%、36.6%。隨著時(shí)間的延長,3種殺菌劑處理14 d后黃瓜內(nèi)生細(xì)菌的 H值逐漸恢復(fù)到處理前的水平,種群結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定。

經(jīng)3種不同殺菌劑處理后,黃瓜莖中不同時(shí)間內(nèi)生細(xì)菌的H值變化如圖3。結(jié)果表明,在黃瓜莖中的 H值變化比較平穩(wěn),較之于對(duì)照,處理后的樣品的H值也是整體降低的。處理1 d后,農(nóng)用鏈霉素,苯醚甲環(huán)唑和代森鋅處理的樣品的H值較空白對(duì)照變化率達(dá)到最大,分別減少了34.2%、31.3%、24.7%。隨著時(shí)間的延長,3種殺菌劑處理14 d后黃瓜內(nèi)生細(xì)菌的 H值逐漸恢復(fù)到處理前的水平,種群結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定。

經(jīng)3種不同殺菌劑處理后,黃瓜根中不同時(shí)間內(nèi)生細(xì)菌的H值變化如圖4。結(jié)果表明,黃瓜根部處理樣品的H值變化比較特殊,與對(duì)照相比呈現(xiàn)上升趨勢(shì),并且在3 d,農(nóng)用鏈霉素、苯醚甲環(huán)唑和代森鋅處理樣品的 H值較空白對(duì)照變化率達(dá)到最大,分別增加了57.5%、53.8%、38.6%。隨著時(shí)間的延長,3種殺菌劑處理14 d后黃瓜內(nèi)生細(xì)菌的H值逐漸恢復(fù)到處理前的水平,種群結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定。

圖4 黃瓜根部不同時(shí)間內(nèi)生細(xì)菌的H值變化

2.2.2 3種殺菌劑處理黃瓜葉、莖、根后,內(nèi)生細(xì)菌T-RFs片段優(yōu)勢(shì)度變化情況

根據(jù)Shannon-Weiner指數(shù)分析得到3種殺菌劑處理黃瓜葉片第5天時(shí),H值較空白對(duì)照變化最大,在此僅對(duì)第5天黃瓜葉片內(nèi)生細(xì)菌T-RFs片段優(yōu)勢(shì)度進(jìn)行分析。

經(jīng)3種殺菌劑處理第5天,黃瓜葉片內(nèi)生細(xì)菌T-RFs片段的優(yōu)勢(shì)度變化情況如圖5。與對(duì)照樣品相比,經(jīng)殺菌劑處理后各T-RFs片段優(yōu)勢(shì)度都呈下降趨勢(shì)。其中,長度為 151 、203、243、326 bp 片段所屬的細(xì)菌在經(jīng)農(nóng)用鏈霉素處理后的樣品里已經(jīng)消失,193 bp片段所屬的細(xì)菌在經(jīng)苯醚甲環(huán)唑處理后的樣品里已經(jīng)消失,305 bp片段所屬的細(xì)菌在經(jīng)代森鋅處理后的樣品里已經(jīng)消失,表明這些片段所屬的微生物分別對(duì)這3種農(nóng)藥比較敏感。另外,對(duì)照樣品的主要片段是283 bp,優(yōu)勢(shì)度達(dá)到了27.2%,葉片中的內(nèi)生細(xì)菌主要集中在這個(gè)片段所代表的微生物中。

圖5 3種殺菌劑處理后第5天黃瓜葉片內(nèi)生細(xì)菌T-RFs片段優(yōu)勢(shì)度變化情況

Phy logenetic Assignment Tool比對(duì)結(jié)果如表1,與283 bp相匹配的細(xì)菌大都為擬桿菌門(Bacteroidetes)。326 bp相匹配的細(xì)菌為厚壁菌門(Firmicutes)?？梢姅M桿菌門和厚壁菌門類群的細(xì)菌在黃瓜葉片內(nèi)較為豐富。與193 bp相匹配的細(xì)菌大多屬于慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)和交替單胞菌科(A lteromonadales),可見苯醚甲環(huán)唑?qū)Ζ?和γ-變形細(xì)菌的影響較大。與305 bp相匹配的細(xì)菌有梭菌屬(C lostrid ium),真桿菌屬(Eubacterium),蒂希耶爾菌屬(Tissierella),說明代森鋅對(duì)厚壁菌門的影響很大。在這3種殺菌劑中農(nóng)用鏈霉素對(duì)于黃瓜內(nèi)生細(xì)菌的影響最大,有多個(gè) T-RFs片段都消失,這些片段代表的細(xì)菌種類很多,可知厚壁菌門,β-和δ-變形細(xì)菌對(duì)農(nóng)用鏈霉素比較敏感。

經(jīng)3種殺菌劑處理黃瓜莖部第1天,H值較空白對(duì)照變化最大,此時(shí)的黃瓜莖內(nèi)生細(xì)菌T-RFs片段的相對(duì)豐度變化情況如圖6。結(jié)果表明,經(jīng)3種殺菌劑處理后各T-RFs片段優(yōu)勢(shì)度也都呈下降趨勢(shì),但并沒有出現(xiàn)了T-RFs片段的消失,3種殺菌劑對(duì)黃瓜莖的影響相對(duì)于葉片較小。另外,對(duì)照樣品的主要片段是222,283,326 bp,相對(duì)豐度分別達(dá)到了14.8%,17.9%,14.7%,片段222 bp相對(duì)豐度明顯高于葉片,其所屬的細(xì)菌種群(表1)主要為β-變形細(xì)菌,α-變形細(xì)菌和厚壁菌門?？梢娫邳S瓜莖部這3類的細(xì)菌比在葉片豐富。

表1 Phylogenetic Assignment Tool比對(duì)結(jié)果

圖6 3種殺菌劑處理第1天黃瓜莖內(nèi)生細(xì)菌T-RFs片段優(yōu)勢(shì)度變化情況

經(jīng)3種殺菌劑處理黃瓜根部第3天,H值較空白對(duì)照變化最大,黃瓜根內(nèi)生細(xì)菌T-RFs片段的相對(duì)豐度變化情況如圖7。結(jié)果表明,黃瓜根部的內(nèi)生細(xì)菌在3種殺菌劑處理后各個(gè)T-RFs片段所屬的細(xì)菌相對(duì)豐度都出現(xiàn)了不同程度的增加,這與在葉片和莖部的內(nèi)生細(xì)菌的變化情況有很大的不同。另外,對(duì)照樣品的主要片段是222 bp和283 bp,相對(duì)豐度分別為20%和19%。所屬的細(xì)菌類群(表1)有擬桿菌門,β-變形細(xì)菌,厚壁菌門,α-變形細(xì)菌?？芍邳S瓜根部的優(yōu)勢(shì)種群主要是這三大細(xì)菌類群。

3 結(jié)論與討論

農(nóng)用鏈霉素、苯醚甲環(huán)唑、代森鋅為防治蔬菜病害的常用殺菌劑,這3種殺菌劑處理后均使黃瓜葉、莖中內(nèi)生細(xì)菌的多樣性指數(shù)減少。而在黃瓜根部,3種殺菌劑處理的內(nèi)生細(xì)菌多樣性指數(shù)卻有所升高,這說明了不同處理的殺菌劑雖然改變了內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性,但是多樣性并不簡(jiǎn)單地因污染而降低。其原因可能是與根際土壤的微生物種群之間存在復(fù)雜的相互關(guān)系(如偏利、協(xié)同、共生、偏害、競(jìng)爭(zhēng)等)有關(guān),也可能是一定程度的殺菌劑能改變土壤微生物與黃瓜根部內(nèi)生菌群落原有群落內(nèi)部的種群之間的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,導(dǎo)致黃瓜內(nèi)生菌中其他微生物如真菌或放線菌的種群有所降低,從而使黃瓜根部內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性增加。3種殺菌劑相比,農(nóng)用鏈霉素對(duì)內(nèi)生細(xì)菌的影響最大,代森鋅最小,這可能與3種殺菌劑的特性不同有關(guān),農(nóng)用鏈霉素和苯醚甲環(huán) 唑是內(nèi)吸性殺菌劑,而代森鋅是保護(hù)性殺菌劑。

圖7 3種殺菌劑處理第3天黃瓜根內(nèi)生細(xì)菌T-RFs片段優(yōu)勢(shì)度變化情況

由于不同長度的T-RFs片段必然代表不同的微生物,而且相同長度的T-RFs片段代表至少一種微生物的存在(長度相同,堿基序列不一定相同),所以這些末段標(biāo)記的片段可以用來反映微生物菌落組成情況[18]。T-RFLP分析結(jié)果表明擬桿菌門,厚壁菌門,α-和β-變形細(xì)菌為黃瓜根莖葉中的優(yōu)勢(shì)種群。Ueda等[19]分析水稻根中的固氮細(xì)菌多樣性,結(jié)果表明水稻根中變形細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)種群。Sessitsch等[14]對(duì)馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了分析,序列分析表明內(nèi)生細(xì)菌屬于 α-、β-、γ-變形細(xì)菌及厚壁菌門。可見變形菌門和厚壁菌門中的一些細(xì)菌為多種植物中的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌。3種殺菌劑處理后對(duì)黃瓜葉片中內(nèi)生細(xì)菌的影響最大,出現(xiàn)了6個(gè)T-RFs片段的消失,這些片段所代表的細(xì)菌類群大都為變形菌門,和厚壁菌門。說明變形菌門和厚壁菌門的細(xì)菌類群對(duì)殺菌劑比較敏感,最容易受到殺菌劑的影響,也說明了殺菌劑對(duì)植物葉片的作用最為直接。

3種殺菌劑處理黃瓜根莖葉1～5 d的種群變化達(dá)到最大,14 d后黃瓜內(nèi)生細(xì)菌的多樣性指數(shù)趨于穩(wěn)定,逐漸恢復(fù)到處理前的水平。原因很多,首先,內(nèi)生細(xì)菌長期生活在植物體細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間隙這樣一個(gè)特殊環(huán)境中,與寄主植物協(xié)同進(jìn)化,并形成了互利共生的關(guān)系。內(nèi)生菌能夠增強(qiáng)寄主植物對(duì)生物脅迫和非生物脅迫的抗逆性,其自身合成的抗生素、激素、酶抑制劑、誘導(dǎo)物等多種活性物質(zhì)或通過誘導(dǎo)物脅迫寄主植物合成萜類,生物堿,皂苷,黃酮,酚類和多炔類等次生代謝物能對(duì)殺菌劑有一定的降解作用。另外,黃瓜中內(nèi)生細(xì)菌種類繁多,有些內(nèi)生細(xì)菌對(duì)殺菌劑不敏感,甚至還有些內(nèi)生細(xì)菌可能把其作為營養(yǎng)物質(zhì)加以利用。所以,反過來內(nèi)生細(xì)菌也能降解黃瓜中殘留的殺菌劑,即起解毒作用,從而使短期內(nèi)黃瓜內(nèi)生細(xì)菌生態(tài)能恢復(fù)平衡。但對(duì)于經(jīng)常連續(xù)使用高濃度殺菌劑的菜地,殺菌劑在土壤中是否有富集、富集的濃度及其對(duì)植物內(nèi)生菌的影響還有待進(jìn)一步研究。

[1]Stone JK,Bacon C W,W hite JF Jr.An overview of endophyticMicrobes：endophy tisMdefined[M].New York：Mareel Dekker,2000：3-29.

[2]Mocali S,Bertelli E,DiCellof,et al.Fluctuation of bacteria isolated fromelMtissues during differen t seasonsand fromdifferent plan t organs[J].Research in Microbiology,2003,154(2)：105-114.

[3]Dan ti R,Sieber T N,SanguinetiG,et al.Decline in diversity and abundance of endophytic fungi in twigs of Fagus sy lvatica L.after experiMental long-terMexposu re to sodiuMdodecylbenzene sulphonate(SDBS)aerosol[J].EnvironMen tal Microbiology,2002,4(11)：696-702.

[4]張保國,唐玲,李祖明,等.阿維菌素殺蟲劑對(duì)甘藍(lán)葉際微生物群落結(jié)構(gòu)的影響[J].環(huán)境科學(xué),2009,30(5)：1292-1297.

[5]Seghers D,Wittebolle L,Top E M,et al.Impact of ag ricultural practices on the Zea mays L.endophytic comMunity[J].Applied and EnvironMentalMicrobiology,2004,70：1475-1482.

[6]Lukow T,Dunfield P F,Liesack W.Use of the T-RFLP technique to assess spatial and teMporal changes in the bacterial comMunity structure with in an agricultural soil p lan ted with transgenic and non-transgenic potato plants[J].FEMS Microbiology Ecology,2000,32(3)：241-247.

[7]Dunbar J,Ticknor L O,Kuske C R.Phylogenetic specificity and reproducibility and new method for analysis of terMinal restriction fragMen t profiles of 16S rRNA genes frombacterial comMunities[J].App lied and EnvironMen tal Microbiology,2001,67(1)：190-197.

[8]Marsh T L.Terminal restriction fragment length polymorphism(TRFLP)：An emergingmethod for characterizing diversity among hoMologous populations of aMplification p rodu cts[J].Cu rren t Opinion in Microbiology,1999,2(3)：323-327.

[9]C lement BG,Keh l L E,DeBord K L,et al.TerMinal restriction fragment patterns(TRFPs),a rapid,PCR-based method for the comparison of complex bacterialcommunities[J].Journal of MicrobiologicalMethods,1998,31(3)：135-142.

[10]Babich E,Stotzky G.Developing standard for environmental toxicants：the need to consider abiotic environMental factors and Microbe-Mediated ecologic processes[J].Environmental H ealth Perspectives,1983,49：247-260.

[11]段學(xué)軍,閔航.鎘脅迫下稻田土壤微生物基因多樣性的DGGE分子指紋分析[J].環(huán)境科學(xué),2004,25(5)：122-126.

[12]Chinalia F A,KillhaMK S.2,4-Dichlorophenoxyacetic acid(2,4-D)biodegradation in river sediments of Northeast-Scotland and its effect on the microbial communities(PLFA and DGGE)[J].Chemosphere,2006,64：1675-1683.

[13]王珍,方宣鈞.植物DNA分離[J].分子植物育種,2003,1(2)：281-288.

[14]Sessitsch A,Reiter B,Pfeifer U,et al.Cu ltivation-independen t population analysis of bacterial endophytes in three potato varieties based on eubacterial and actinomycetes-specific PCR of 16S rRNA genes[J].FEMS Microbiology Ecology,2002,39：23-32.

[15]賈俊濤,宋林生,李筠.T-RFLP技術(shù)及其在微生物群落結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用[J].海洋科學(xué),2004,28(3)：64-68.

[16]王洪媛,江曉路,管華詩.微生物生態(tài)學(xué)一種新研究方法TRFLP技術(shù)[J].微生物學(xué)通報(bào),2004,31(6)：90-94.

[17]余素林,吳曉磊,錢易.環(huán)境微生物群落分析的 T-RFLP技術(shù)及其優(yōu)化措施[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2006,12(6)：861-868.

[18]宋福強(qiáng).微生物生態(tài)學(xué)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2008：7-21.

[19]Ueda T,Suga Y,Yahiro N,etal.Remarkab le N2-Fixing bacterial diversity detected in rice roots by molecular evolu tionary analy sis of ni fH gene sequences[J].Jou rnal of Bacteriology,1995,177(5)：1414-1417.