云南、貴州玉米大斑病菌生理小種分化研究

何澤民, 李晚忱, 王曉鳴

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/農(nóng)作物基因資源與基因改良國(guó)家重大科學(xué)工程,北京 100081;2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所,雅安 625014)

玉米是云南省和貴州省的第一大糧食作物,種植面積分別達(dá)132.6萬(wàn)hm2和73.5萬(wàn)hm2,是云貴山區(qū)農(nóng)民的重要糧食和畜牧業(yè)飼料[1]。云貴地區(qū)屬于西藏臺(tái)地的延伸部分,平均海拔高,屬溫帶、亞熱帶、熱帶濕潤(rùn)半濕潤(rùn)氣候,具有熱量豐富、降雨豐沛、光照條件差、立體氣候明顯等特點(diǎn)[2]。云貴地區(qū)的農(nóng)業(yè)耕地主要分布在丘陵山地,而玉米又主要種植在土壤比較瘠薄的山上,生長(zhǎng)期處于多雨、多霧、寡照、溫度較低的環(huán)境中,這種生產(chǎn)條件為玉米大斑病在兩省的發(fā)生奠定了基礎(chǔ)。2008年,國(guó)家玉米產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專(zhuān)家對(duì)西南地區(qū)的玉米病蟲(chóng)害調(diào)查報(bào)告指出,大斑病是云貴玉米生產(chǎn)的主要限制因素之一,大斑病在兩省普遍發(fā)生并有逐年加重的趨勢(shì),在云南西北和西南、貴州北部地區(qū)持續(xù)嚴(yán)重發(fā)生,給當(dāng)?shù)氐挠衩咨a(chǎn)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3]。高原地域的特殊性使玉米大斑病在云貴地區(qū)發(fā)生具有如下特點(diǎn)：發(fā)生危害早,流行蔓延快;隨海拔高度增加而玉米發(fā)病呈加重趨勢(shì);在低海拔地區(qū),大斑病和小斑病混合發(fā)生[4-5]。

玉米大斑病是一種嚴(yán)重的玉米葉枯性病害,由大斑剛毛球腔菌(Setosphaeria turcica,無(wú)性態(tài)為大斑凸臍蠕孢ExserohiluMturcicum)引起,病原菌存在針對(duì)不同抗性基因的生理小種。從1922年印度學(xué)者M(jìn)itra報(bào)道玉米大斑病菌生理分化現(xiàn)象以來(lái),已先后在美國(guó)夏威夷、伊利諾斯、德克薩斯等地發(fā)現(xiàn)了1號(hào)、23號(hào)、23N 號(hào) 、2N 號(hào)小種[6-9];我國(guó)小種分化研究始于20世紀(jì)70年代末,到目前為止,已發(fā)現(xiàn)針對(duì)抗大斑病基因 H t1、H t2、H t3和H tN 所有組合的16種小種類(lèi)型[10-14]。云南和貴州是玉米大斑病多發(fā)地區(qū),對(duì)其流行的病菌小種進(jìn)行鑒定和研究小種變異動(dòng)態(tài),有助于玉米生產(chǎn)中抗病品種的合理布局和抗病育種目標(biāo)的確定。

本研究采用常規(guī)鑒別寄主鑒定方法,對(duì)從云南、貴州部分地區(qū)采集分離的玉米大斑病菌進(jìn)行生理小種鑒定,以明確云貴地區(qū)近兩年來(lái)玉米大斑病菌小種變化及其對(duì)抗大斑病基因的致病水平。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

2008年和2009年從云南8個(gè)市(州)16個(gè)縣(市)25個(gè)采樣點(diǎn)采集獲得30份玉米大斑病葉標(biāo)樣;2008年從貴州3個(gè)市3個(gè)縣12個(gè)采樣點(diǎn)采集到15份玉米大斑病葉標(biāo)樣。采用組織分離法分離大斑病菌,在PDA培養(yǎng)基上純化,純化后菌株保存至PDA斜面試管待用。

1.2 供試鑒別寄主

采用一套含 Ht單基因的自交系：OH 43H t1、黃早四H t2、黃早四 H t3、黃早四 H tN和黃早四(對(duì)照),進(jìn)行小種鑒別接種。小種鑒定重復(fù)2次。

1.3 生理小種鑒定

將鑒別寄主分別播種于直徑15 cm的花盆內(nèi),置于溫室中,待出苗后每盆留苗3株。供試菌株接種至PDA平板培養(yǎng)基上,在25℃下培養(yǎng)12 d。玉米長(zhǎng)至4葉期時(shí)進(jìn)行接種。在培養(yǎng)的大斑病菌培養(yǎng)皿內(nèi)加入適量無(wú)菌水,用毛筆小心將菌落上的大斑病菌孢子刷下,液體經(jīng)細(xì)密的銅濾網(wǎng)過(guò)濾,然后轉(zhuǎn)至50 ML三角瓶中,配成濃度約為4×105個(gè)孢子/ML的懸浮液,向其中加入少許吐溫20,用高壓噴霧器進(jìn)行噴霧接種,每菌株接5盆。接種后的植株在保濕間內(nèi)26℃、95%濕度條件下保濕48 h,然后移到溫室進(jìn)行正常管理。約在接種5 d后葉片出現(xiàn)明顯病斑,此時(shí)進(jìn)行第1次調(diào)查。每次調(diào)查間隔3 d,共調(diào)查3次。

1.4 鑒定標(biāo)準(zhǔn)

鑒定以病斑反應(yīng)類(lèi)型為標(biāo)準(zhǔn)。R型：病斑初為黃綠色水浸狀條斑,后中間變褐成壞死斑,邊緣有明顯的較寬的黃色暈圈,病斑狹長(zhǎng),稱(chēng)為褪綠斑;S型：病斑初為灰綠色水浸狀斑,后擴(kuò)展為大的梭形斑,灰褐色,邊緣無(wú)明顯暈圈,稱(chēng)為萎蔫斑。

1.5 生理小種命名

采用1989年 Leonard等建議的大斑病菌生理小種命名法,以無(wú)效寄主基因的序號(hào)作為該小種的名稱(chēng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 云貴兩地大斑病菌小種構(gòu)成與主要致病小種分析

2.1.1 云南玉米大斑病菌生理小種構(gòu)成與分布特點(diǎn)

在云南省的30個(gè)玉米大斑菌標(biāo)樣中,共鑒定出8 個(gè)生理小種,即 ：12、13、3N 、123、12N 、13N 、23N 、123N。在30個(gè)標(biāo)樣中,出現(xiàn)頻率最高的是小種123N號(hào),占30.0%,小種23N號(hào)為23.3%,13N號(hào)小種為20.0%,123號(hào)小種為10.0%,12號(hào)小種為6.7%,而小種 13號(hào)、3N號(hào)、12N號(hào)均為 3.3%。13N、23N和123N 3個(gè)小種占出現(xiàn)頻率的73.3%,是構(gòu)成云南玉米大斑病菌的主要致病群體。

不同生理小種在云南的分布情況表明(表1)：德宏州(潞西市)以12N 、23N 、123N 小種為主,保山市(騰沖、施甸 、昌寧)以3N 、13N 、23N 和 123N 號(hào)小種為主,大理州(大理、賓川)以123、13N、123N 為主,臨滄市(云縣、鳳慶)以 123N 為主,楚雄市(楚雄)以123N為主,普洱市(墨江)以13號(hào)小種為主,昆明市(宜良)以13N號(hào)小種為主,紅河州(彌勒)以12號(hào)小種為主,文山州(文山、馬關(guān))以23N號(hào)小種為主。玉米大斑病菌在云南分布廣泛,尤其在云南西部靠近緬甸的德宏傣族景頗族自治州和保山市,小種類(lèi)型多。在云南全境,小種分化明顯,種類(lèi)多,毒力強(qiáng),西部小種類(lèi)型多,東部略少。

2.1.2 貴州玉米大斑病菌生理小種構(gòu)成與分布

在貴州省分離獲得的15個(gè)玉米大斑病菌標(biāo)樣中,鑒定出123、13N、23N和123N共4個(gè)生理小種。在4個(gè)小種中,123N號(hào)小種的出現(xiàn)頻率達(dá)53.3%,屬于貴州省的優(yōu)勢(shì)小種,而13N和23N號(hào)小種分別為20.0%,小種123號(hào)出現(xiàn)頻率最低,為6.7%。

表1 玉米大斑病菌生理小種在云南的分布

對(duì)大斑病菌生理小種在貴州的分布分析表明(表2)：在玉米大斑病嚴(yán)重發(fā)生地區(qū),畢節(jié)市(金沙縣 、畢節(jié)縣 、大方縣)以123、23N 、123N 為主,貴陽(yáng)市以123N為主,遵義市(遵義縣)以 13N、23N、123N為主,其中在畢節(jié)地區(qū),123N號(hào)小種所占比例很高,毒性很強(qiáng)。

表2 玉米大斑病菌生理小種在貴州的分布

在總體上,云南和貴州省的玉米大斑病菌生理小種分化明顯,小種類(lèi)型較多,其中能夠同時(shí)克服4個(gè)抗大斑病的 H t基因的小種比例較高,貴州尤其明顯。

2.2 云南和貴州玉米大斑病菌小種毒力頻率分析

2.2.1 云南大斑病菌的毒力頻率

抗病基因的毒性頻率=有毒力菌株數(shù)/測(cè)定總菌株數(shù) ×100%[15]。在所有供試云南菌株中,對(duì)Ht3抗性基因的毒性頻率最高,為90.0%,H t3基因表現(xiàn)為最低有效抗性;對(duì)H t1和H t2的毒性頻率最低,為 73.3%,H t1和 H t2有效抗性最高;對(duì)HtN的毒性頻率為80.0%。云南菌株對(duì) H t單基因的毒性頻率為73.3%～90.0%;對(duì) H t雙基因組合的毒性頻率為50.0%～76.7%;對(duì)H t 3基因組合的毒性頻率為33.3%～53.3%;對(duì)H t 4基因組合的毒性頻率為30.0%。

2.2.2 貴州大斑病菌的毒力頻率

在所有供試貴州菌株中,也是對(duì) H t3抗性基因毒性頻率最高,為100%,對(duì)H t1和H t2的毒性頻率最低,均為80.0%,對(duì)H tN的毒性頻率為93.3%。貴州菌株對(duì) H t單基因的毒性頻率為 80.0%～100%;對(duì) H t雙基因組合的毒性頻率為 60.0%～93.3%;對(duì)H t 3基因組合的毒性頻率為53.3%～73.3%;對(duì)H t 4基因組合的毒性頻率為53.3%。

針對(duì)單一抗大斑病基因的菌株致病性檢測(cè),兩省都表現(xiàn)為H t1和Ht2基因的相對(duì)有效抗性最高,而H t3基因最低。同時(shí),隨著抗性基因組合從單基因、雙基因、3基因至4基因的發(fā)展,抗性的作用逐漸增強(qiáng),病菌的毒性頻率下降。

3 結(jié)論與討論

3.1 云南、貴州玉米大斑病菌小種分化明顯,毒性明顯提高

與前人報(bào)道的鑒定結(jié)果相比較,云南和貴州在近年已出現(xiàn)了許多新的生理小種。

在云南,吳安國(guó)等報(bào)道主要生理小種為0號(hào)(原1號(hào)小種),出現(xiàn)頻率達(dá)96.8%,并在云南發(fā)現(xiàn)了23號(hào)小種(原3號(hào)小種)[16-17]。高衛(wèi)東、戴法超等也報(bào)道云南存在1號(hào)小種[18]。此后10多年間,關(guān)于云南玉米大斑病菌小種的報(bào)道很少。本研究的結(jié)果與已往報(bào)道相比有如下特點(diǎn)：1)云南小種已復(fù)雜化。20世紀(jì)80年代末鑒定的小種主要以0號(hào)小種為主,即H t1、H t2、H t3單基因都具有良好的抗性。目前,云南的大斑病菌小種構(gòu)成已很復(fù)雜,小種種類(lèi)由過(guò)去的4個(gè)增加為8個(gè),并由20世紀(jì)80年代針對(duì)單基因毒力的小種,演變?yōu)獒槍?duì)多基因毒力的小種;2)小種毒力增強(qiáng)。此次鑒定的30個(gè)菌株都能同時(shí)克服2～4個(gè)抗性基因的組合,且能同時(shí)克服3個(gè)或4個(gè)基因的小種比例達(dá)到了86.7%。云南玉米大斑病菌小種的演變,很可能與其復(fù)雜氣候和環(huán)境條件加速病菌變異、病菌間毒性重組存在相關(guān)性。

在貴州,蘭光變等的鑒定證明,黔西北特殊玉米生態(tài)區(qū)和遵義地區(qū)等的玉米大斑病菌存在著0號(hào)、1號(hào)和23號(hào)3個(gè)生理小種,0號(hào)是主要生理小種[19]。李曉等對(duì)四川、貴州兩省玉米大斑病菌小種的鑒定結(jié)果顯示,兩省以0號(hào)小種為主,占鑒定總數(shù)的74.1%,1號(hào)小種占11.8%,23號(hào)小種占4.3%,還有23N號(hào)小種存在,占 3.5%,其他未確定的占6.2%[20]。這些研究已表明,在貴州,玉米大斑病菌的小種是比較復(fù)雜的。本研究的結(jié)果與以往報(bào)道比較呈現(xiàn)如下特點(diǎn)：1)貴州北部地區(qū)的玉米大斑病菌生理小種也已發(fā)生明顯改變,123N已成為該區(qū)域的主要生理小種,同時(shí)出現(xiàn)了一些新的生理小種;2)貴州北部地區(qū)的小種毒力極強(qiáng)。在鑒定出的小種中,全部能夠克服3～4個(gè)抗性基因的組合,而毒性最強(qiáng)的123N小種所占比例達(dá)到53.3%。

3.2 云南、貴州玉米大斑病菌生理小種比較

自20世紀(jì)末以來(lái),玉米大斑病在云南、貴州兩省有不斷擴(kuò)大加重的趨勢(shì),其生理小種也發(fā)生了很大的變化。相比之下,云南玉米大斑病菌的小種類(lèi)型更多,而貴州大斑病菌小種雖不及云南多,但其總體的毒性卻強(qiáng)于云南的小種,這可能與兩地的地理和氣候差異、種植品種不同有關(guān)。但兩省小種有一個(gè)共同特點(diǎn),即能克服4個(gè)抗性單基因組合的123N號(hào)小種正在上升,有可能成為兩地最主要的小種群體,這對(duì)云南和貴州的玉米生產(chǎn)是一個(gè)很大的威脅。

3.3 云貴地區(qū)玉米大斑病菌小種變異加快的原因

我國(guó)玉米大斑病菌生理小種的種類(lèi)由20世紀(jì)90年代前以0號(hào)和1號(hào)小種為主,已演變?yōu)?0年代中期至今各地小種組成日益復(fù)雜的狀況,在以4個(gè)主效抗性基因?yàn)榛A(chǔ)的鑒別體系中,已鑒定出所有可能的16種毒力類(lèi)型小種。玉米大斑病菌小種變異原因主要有4個(gè)：基因突變、生殖方式、選擇作用和基因漂移[21]。云南和貴州地區(qū)小種變異較快、毒力明顯較其他地區(qū)的小種強(qiáng),可能有如下的成因：早在1985年,吳安國(guó)已在云南的宜良和云縣發(fā)現(xiàn)了23號(hào)小種(原文為舊小種命名系統(tǒng)中的3號(hào)小種)的存在[17],云南是我國(guó)最早發(fā)現(xiàn)該小種的地區(qū)。23號(hào)小種能夠克服 H t2、H t3基因,經(jīng)過(guò)20多年的進(jìn)化,云南大斑病菌之間通過(guò)一系列的基因重組,完全能夠產(chǎn)生新的小種。這種基因重組的結(jié)果,最終表現(xiàn)為云南地區(qū)大斑病菌小種的毒力結(jié)構(gòu)以及針對(duì)不同抗大斑病基因組合的毒性頻率之高都不同于其他大斑病發(fā)生地區(qū);此外,云貴玉米生產(chǎn)區(qū)域獨(dú)特的地理?xiàng)l件,即處于低緯度高原地區(qū),氣候的垂直變化顯著,年溫差小,日溫差大,降水充沛,濕度高,山地玉米常處于云霧之中,大斑病發(fā)生充分,病菌完成一個(gè)世代周期短,能夠積累更多的遺傳變異;高海拔地區(qū)在晴日條件下,紫外線輻射劇烈,極易誘發(fā)病菌的突變,這些突變體完全可以通過(guò)重組形成新的具有高毒力的小種;近年來(lái),一些北方培育的玉米品種進(jìn)入云南和貴州,在增加玉米抗性遺傳多樣性的同時(shí),也可能對(duì)該地區(qū)的病菌產(chǎn)生抗性壓力,促其加快遺傳變異,小種間基因交流加強(qiáng),這些都為新小種的形成提供了有利條件。目前,這些對(duì)病菌小種變異成因的推斷還缺乏科學(xué)數(shù)據(jù)的證明,但來(lái)自生產(chǎn)中的信息已證明了云南地區(qū)玉米大斑病病菌生理小種發(fā)生了改變：目前在云南省種植面積最大的品種‘會(huì)單4號(hào)’以及‘保玉7號(hào)’,在審定時(shí)均為高抗大斑病,但在2004年,在一些地區(qū)卻表現(xiàn)為高感大斑病(新華社專(zhuān)稿,2004-10-19),2009年作者的調(diào)查也表明,‘會(huì)單4號(hào)’在田間發(fā)病嚴(yán)重,達(dá)到感病至高感水平。

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