四川盆地部分地區(qū)土壤中蘇云金芽胞桿菌分離與cry基因鑒定*

周長梅, 戴長春, 王曉云, 李 穎, 趙奎軍

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,哈爾濱 150030)

四川盆地部分地區(qū)土壤中蘇云金芽胞桿菌分離與cry基因鑒定*

周長梅, 戴長春, 王曉云, 李 穎, 趙奎軍**

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,哈爾濱 150030)

[目的]對四川盆地土壤中Bt資源進(jìn)行研究,了解其分布特點(diǎn),為我國蘇云金芽胞桿菌的儲備奠定基礎(chǔ)。[方法]從四川盆地5個(gè)地區(qū)采集土樣,分離蘇云金芽胞桿菌野生菌株。利用PCR-RFLP及SDS-PAGE方法對Bt分離株進(jìn)行基因型鑒定和蛋白分析,并對其室內(nèi)殺蟲活性進(jìn)行初步測定。[結(jié)果]從207份土樣中獲得26株蘇云金芽胞桿菌野生菌株,出菌率為12.56%。油鏡觀察可看到球形、方形、菱形及不規(guī)則形的伴胞晶體。在21株Bt分離株中檢測到cry1、cry1I、cry2、cry9四類基因,且多數(shù)菌株都是同時(shí)含有多個(gè)基因類型,有 5株Bt分離株未發(fā)現(xiàn)已知基因;SDS-PAGE顯示有9株菌株只表達(dá)了130 ku的蛋白,2株只表達(dá)了124 ku的蛋白,2株只表達(dá)了45 ku的蛋白,6株同時(shí)表達(dá)了130 ku和60 ku的蛋白,4株同時(shí)表達(dá)了124 ku和60 ku的蛋白,2株同時(shí)表達(dá)了135 ku和60 ku的蛋白,1株同時(shí)表達(dá)了130、90 ku及75 ku的蛋白。毒力測定結(jié)果表明:9株菌株對小菜蛾具有高毒力,2株對大猿葉蟲有一定的殺蟲活性。[結(jié)論]四川盆地土壤中Bt資源多樣性豐富,其中有2株有一定的研究前景。

蘇云金芽胞桿菌;cry基因; PCR-RFLP; 毒力測定

*致 謝: 在整個(gè)取樣過程中得到代勇、周勤、張錦義、羅宏、李良忠等同學(xué)的大力支持和協(xié)助,在此深表感謝!

**通信作者 T el:0451-55191854;E-mail:kjzhao@163.com

蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是自然界中分布十分廣泛的革蘭氏陽性細(xì)菌。該菌的顯著特征是形成芽胞的同時(shí)會產(chǎn)生由cry或cyt基因編碼的殺蟲晶體蛋白(insecticidal crystal protein,ICPs),其對靶標(biāo)昆蟲具有強(qiáng)的毒殺活性,而對人及高等動(dòng)物無害,因此,Bt成為目前世界上應(yīng)用最為廣泛的一種殺蟲微生物,也是轉(zhuǎn)基因抗蟲育種中重要的基因資源。但隨著Bt制劑及轉(zhuǎn)cry基因作物在田間的大量應(yīng)用,靶標(biāo)昆蟲的抗性風(fēng)險(xiǎn)也隨之增強(qiáng)[1-2]。因此充分發(fā)掘我國豐富的Bt資源,篩選高毒力菌株和基因,對蘇云金芽胞桿菌進(jìn)一步的深入研究及開發(fā)利用具有十分重要的意義。

蘇云金芽胞桿菌的分布極其廣泛,在土壤、蟲尸、貯藏物、植被以及污水、塵埃等基質(zhì)上均有廣泛的分布,而在土壤中分布最為豐富[3-4]。四川盆地有其獨(dú)特的地貌及生態(tài)特點(diǎn),地形復(fù)雜,植被多樣且覆蓋率高,使得微生態(tài)系統(tǒng)不易被破壞。因此對四川盆地土壤中Bt資源的研究既有利于了解該地區(qū)Bt資源的分布特點(diǎn),同時(shí)也可為我國蘇云金芽胞桿菌的儲備奠定基礎(chǔ)。作者從四川盆地5個(gè)地區(qū)采集207份土壤樣品,從中分離出26株Bt野生菌株,并進(jìn)行了基因型鑒定、蛋白分析及殺蟲活性檢測。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨1%、酵母提取物0.5%、NaCl 1%。pH調(diào)至 7.0～7.2,固體培養(yǎng)基加入1.8%的瓊脂粉。121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1/2 LB培養(yǎng)基:除瓊脂粉及pH不變,其他成分減半。

1.2 土樣的采集方法

土樣采自雅安、重慶、內(nèi)江、樂山、成都5個(gè)地區(qū)。先將表土層鏟去1～2 cm,再取5～10 cm土層的土壤約50 g,采用五點(diǎn)取樣法,每個(gè)采樣點(diǎn)至少取5處,將采集的土樣裝入無菌牛皮紙袋內(nèi)備用,并標(biāo)明采集地點(diǎn)、植被、日期等。

1.3 菌株分離及篩選方法

采用醋酸鈉選擇性篩選法進(jìn)行菌株分離[5]:稱取1.0 g土樣,放入盛有50 mL(含3.4%醋酸鈉)的液體LB培養(yǎng)基中,30℃條件下,200 r/min振蕩培養(yǎng)4 h;取土壤懸浮液10 mL,3 000 r/min離心15 min;取上清液1.5 mL于Eppendorf管中,75℃水浴15 min,取0.1 mL涂于LB培養(yǎng)基上,30℃倒置培養(yǎng)3 d。伴胞晶體的觀察方法參見伯杰氏鑒定手冊。

1.4 cry基因的PCR-RFLP初步分析

參照Kuo及宋福平等根據(jù)基因保守區(qū)設(shè)計(jì)的通 用引 物:K5un2/K3un2、K5un3/K3un3、S5uni/S3uni等共10對,鑒定Bt菌株的cry1/7/9、cry1I、cry2、cry3、cry4/10、cry5、cry6、cry8和cry11類基因[6-7]。PCR反應(yīng)參數(shù):94℃1 min,52℃1 min,72℃2 min,共30個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的RFLP分析參照文獻(xiàn)[6-7]。

1.5 Bt分離株殺蟲晶體蛋白的SDS-PAGE分析

將活化過夜的Bt菌畫線于1/2 LB培養(yǎng)基上,30℃倒置培養(yǎng)48 h,刮取2 mg左右菌體于1 mL ddH2O中,12 000 r/min離心1 min,棄上清;加入NaCl(1 mol/L)400 μ L 懸 浮,12 000 r/min 離 心2 min,棄上清;加入 100 mL ddH2O懸浮,加入NaOH(0.5 mol/L)25 μ L 于室溫放置 5 min,加入1/3體系的 3×Sample Buffer(T ris3.63 g,溴酚藍(lán)0.3 g,SDS 6 g,甘油 30 mL,β-巰基乙醇 15 mL,調(diào)pH6.8定容至100 mL)65 μ L,100 ℃煮沸 10 min,12 000 r/min離心10 min,取上清-20℃保存?zhèn)溆?。SDS-PAGE分析方法參見文獻(xiàn)[8],以相對遷移率與已知蛋白分子量的半對數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線測定蛋白的分子量。

1.6 胞晶混合物的制備

將蘇云金芽胞桿菌在LB平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)至胞晶分離,用含0.01%T riton-100的 1 mol/L的NaCl收集菌體,用無菌水洗滌3次后再重懸,將該胞晶混合物置于4℃冰箱備用。

1.7 室內(nèi)殺蟲活性檢測

小菜蛾(Plutella xy lostellaL.)初孵幼蟲,采自園藝實(shí)驗(yàn)站;大猿葉蟲幼蟲(Colaphellus bowringiiL.)由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)害蟲生物防治實(shí)驗(yàn)室提供。將胞晶混合物用無菌水稀釋成不同濃度。采用浸葉法進(jìn)行飼喂,將甘藍(lán)和小白菜葉片用清水洗凈晾干,在稀釋好的待測樣品中浸泡10 min,晾干,放入生測瓶中,每瓶放入2～3齡幼蟲20頭,每個(gè)處理3次重復(fù),飼喂2 d(大猿葉蟲)和4 d(小菜蛾)后調(diào)查死、活蟲數(shù)。計(jì)算其校正死亡率。以無菌水作空白對照,設(shè)3個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bt菌的分離及伴胞晶體形態(tài)的多樣性

從四川盆地雅安、重慶、內(nèi)江、樂山、成都5個(gè)地區(qū)采集的207份土樣中,共分離出26株Bt野生菌株,出菌率為12.56%(表1)。從表1可以看出:Bt分布的豐度與生態(tài)環(huán)境有很大關(guān)系。采自雅安地區(qū)的山林土出菌率最高,為23.07%,其次為采自樂山的山林土及雅安的茶園土,出菌率分別為12.50%及11.76%;而農(nóng)田土的出菌率均低于山林土,這可能由于山區(qū)植被茂密、表土腐殖質(zhì)含量高,微生態(tài)系統(tǒng)不被破壞,導(dǎo)致山林土出菌率較高。

表1 Bt菌的分離結(jié)果

顯微鏡檢測發(fā)現(xiàn)26株Bt分離株伴胞晶體的形態(tài)有球形、方形、菱形及不規(guī)則形,且多數(shù)菌株都同時(shí)含有多種形態(tài)的伴胞晶體,充分體現(xiàn)了四川盆地Bt菌株資源的多樣性(圖1)。其中只含有菱形晶體的菌株5株,同時(shí)含有菱形、方形、球形晶體的菌株13株,既含有方形又含有球形及不規(guī)則形晶體的菌株8株。

圖1 在光學(xué)顯微鏡下(100×油鏡)觀察到的Bt菌株

2.2 Bt分離株的SDS-PAGE分析

對26株蘇云金芽胞桿菌SDS-PAGE分析結(jié)果表明(表2、圖2)。有9株菌株只表達(dá)了130 ku的蛋白,有2株只表達(dá)了124 ku的蛋白,有2株只表達(dá)了45 ku的蛋白,有6株同時(shí)表達(dá)了130 ku和60 ku的蛋白,有4株同時(shí)表達(dá)了124 ku和60 ku的蛋白,有2株同時(shí)表達(dá)了135 ku和60 ku的蛋白,有1株同時(shí)表達(dá)了130、90 ku及75 ku的蛋白。

圖2 部分Bt分離株的SDS-PAGE分析

表2 Bt分離株的基因型、晶體蛋白及毒力檢測結(jié)果

在目前已知的蘇云金芽胞桿菌各種基因類型中,cry1和cry9類基因表達(dá)的蛋白分子量約為130 ku;而cry2類基因表達(dá)的蛋白在60 ku左右;cry1I類表達(dá)81 ku的蛋白,但SDS-PAGE分析的26株菌株中并未檢測到81 ku的條帶,有文獻(xiàn)報(bào)道cry1I類基因通常是沉默的[9],本文的研究結(jié)果也印證了這一觀點(diǎn)。

2.3 Bt分離株的cry基因鑒定

通過PCR-RFLP鑒定體系對分離到的26株Bt菌株進(jìn)行了cry基因的鑒定。結(jié)果表明(表2、圖3):有21株菌株含有cry1型基因,8株含有cry1I型基因,11株含有cry2型基因,13株含有cry9型基因;在已鑒定出基因型的21株菌株中,只有5株只含cry1類基因,其余16株菌株均是含有多種類型基因的組合,由表2可以看出cry1Aa、cry1Ac、cry1Ib、cry2Ba、cry9Ba基因型最豐富,同時(shí)含有cry1、cry1I、cry2、cry9類基因型的菌株最多為 6株,占已鑒定出基因型菌株的28.57%。另外5株菌株未鑒定出已知基因,有待于重新設(shè)計(jì)引物進(jìn)行進(jìn)一步的分析鑒定。

圖3 部分Bt分離株的PCR-RFLP

2.4 Bt分離株的殺蟲活性檢測

對26株Bt菌株進(jìn)行了小菜蛾及大猿葉蟲的室內(nèi)殺蟲活性檢測。結(jié)果表明(表2):有9株菌株對小菜蛾具有高毒力,4 d的校正死亡率達(dá)100%,卻沒有發(fā)現(xiàn)對大猿葉蟲具有高毒力的菌株,只有菌株BF-5及CHD4對大猿葉蟲表現(xiàn)出一定的活性,2 d的校正死亡率分別為42.9%及41.7%。

3 結(jié)論與討論

從四川盆地5個(gè)地區(qū)的山林土及農(nóng)田土采集的207份土樣中,共分離出26株Bt野生菌株,平均出菌率為12.56%。伴胞晶體的形態(tài)有球形、方形、菱形及不規(guī)則形,且多數(shù)菌株都同時(shí)含有多種形態(tài)的伴胞晶體,充分體現(xiàn)了四川盆地Bt菌株資源多樣性的特點(diǎn)。通常蘇云金芽胞桿菌的資源分布受土壤類型、pH、土壤腐殖質(zhì)含量、植被類型等生態(tài)環(huán)境影響[10-11]。本研究中采樣點(diǎn)雅安地區(qū)的山林和峽谷植被保存完好,覆蓋率高,表土中腐殖質(zhì)含量高,采自該地區(qū)山林土的Bt出菌率最高為23.07%,且207份土樣中,山林土的Bt出菌率均高于農(nóng)田土的出菌率,也充分說明了Bt菌株的分布規(guī)律。

通過鑒定發(fā)現(xiàn)26株Bt菌中共含有cry1、cry1I、cry2、cry94種基因類型,且多數(shù)菌株同時(shí)含有多個(gè)基因類型。除普遍存在的cry1類基因外,cry9、cry2類基因也有較高頻率,顯示出四川盆地Bt菌株基因型較豐富的特點(diǎn)。

不同類型的cry基因編碼的蛋白表現(xiàn)出不同的殺蟲特異性。通常cry1、cry2、cry9基因編碼的晶體蛋白對鱗翅目害蟲具有毒殺活性[12],本研究中對小菜蛾具有高毒力的9株菌株均含有這幾類基因的基因組合,由此可見含有多種基因類型的菌株通常具有較高的殺蟲活性。自Tailor于1992年克隆的第1個(gè)cry1Ia1基因?qū)[翅目和鞘翅目的害蟲具有雙重殺蟲活性[13],此后又發(fā)現(xiàn)cry1Ia7對葉甲科馬鈴薯甲蟲具有很高的殺蟲活性[14]。本研究中得到的菌株BF-5及CHD4除對小菜蛾具有高活性外,對大猿葉蟲也表現(xiàn)出較好的殺蟲活性,校正死亡率分別為42.9%及41.7%,在這兩個(gè)菌株中均未鑒定出cry3、cry8及cry1Ia等對鞘翅目具有殺蟲活性的基因型,但SDS-PAGE分析表明這兩個(gè)菌株分別表達(dá)了124 ku及135 ku較特殊的蛋白條帶,說明在這兩個(gè)菌株中可能含有新的基因或新的殺蟲活性物質(zhì)。這些研究結(jié)果將為今后蘇云金芽胞桿菌的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

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Isolation and cry gene identification of Bacillus thuringiensis from the soils in some regions of Sichuan Basin

Zhou Changmei, Dai Changchun, Wang Xiaoyun, Li Ying, Zhao Kuijun
(College of Agriculture,Northeast Agricultural University,Harbin150030,China)

[Objective]The resources ofBacillus thuringiensisin Sichuan Basin were studied to understand their distribution characteristics and prepared for their use in the future.[Method]Soil samples were collected from five regions of Sichuan Basin toscreen the Bt strains.The genotypes and insecticidal crystal protein(ICPs)of the strains isolated were identified by PCR-RFLP and SDS-PAGE,respectively.The toxicity of the Bt strains toPlutella xylostellaandColaphellus bowringiiwere evaluated in the lab.[Result]Twenty-six wild strains ofBacillus thuringiensiswere isolated from 207 soil samples,which accounted for 12.56%of the soil samples tested.Various shapes of parasporal crystals,includingspherical,square,bipyramidal and irregular,were observed in the strains.The genescry1,cry1I,cry2andcry9were found in 21 strains,and most of them contained more than one gene.However,no known genes were detected in the other five strains.Nine strains expressed the protein of 130 ku,and two strains expressed the protein of 124 ku,and two strains expressed the protein of 45 ku.But six strains expressed both 130 ku and 60 ku proteins,four strains expressed both 124 ku and 60 ku proteins,two strains expressed both 135 ku and 60 ku proteins,and one strain simultaneously expressed 130 ku,90 ku and 75 ku proteins.The bioassay results of the 26 strains indicated that nine of them were highly toxic toPlutellaxylostellaand two of the nine strains showed some toxicity toColaphellus bowringiilarvae.[Conclusion]There are rich Bt resources in Sichuan Basin,and 2 Bt stains isolated from there showed high prospective value.

book=21,ebook=394

Bacillus thuringiensis;crygene; PCR-RFLP; toxicity assay

S 482.39

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2011.02.004

2010-03-11

2010-05-25

國家公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(200803032)