丹紅注射液改善VD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力作用機(jī)制研究

金 杰，任素華，苗彥永

(1.河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450008;2.新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453000)

血管性癡呆(Vascular Dementia，VD)是由各種腦血管因素導(dǎo)致腦組織損害而引起的獲得性智能損害綜合征，是常見的老年期癡呆之一。目前，血管性癡呆的治療尚無突破，中醫(yī)藥對(duì)本病的治療具有一定優(yōu)勢。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

健康清潔SD大鼠48只，雌雄各半，體重200 g±20 g，由河南省動(dòng)物研究中心提供，編號(hào) SCXK(豫)2005-0001。按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組:假手術(shù)組、模型組、杏丁組、丹紅組+模型組+杏丁組組合稱為手術(shù)組，每組12只，以3%苦味酸分別做體表標(biāo)記。

1.2 造模及行為學(xué)觀察

采用王蕊[1]改進(jìn)的兩血管阻斷 +硝普鈉降壓法制作VD大鼠模型，應(yīng)用避暗實(shí)驗(yàn)法[2]判定造模成功與否及大鼠用藥后的學(xué)習(xí)記憶改善情況。避暗實(shí)驗(yàn)方法為:根據(jù)大鼠的嗜暗習(xí)性分設(shè)明暗兩室，明室上方20cm處懸掛60W日光燈，在暗室的中后部分底部銅柵加40V的電壓，兩室之間設(shè)有直徑為3cm的圓洞。實(shí)驗(yàn)時(shí)將大鼠背對(duì)洞口放入明室，同時(shí)啟動(dòng)計(jì)時(shí)器，動(dòng)物放入明室至第1次進(jìn)入暗室遭電擊所需的時(shí)間為潛伏期，記錄大鼠第1次進(jìn)入暗室的時(shí)間(潛伏期)及5min內(nèi)動(dòng)物遭電擊次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù))。于造模后和連續(xù)給藥14d后分別進(jìn)行行為學(xué)測試，記錄大鼠第1次進(jìn)入暗室的時(shí)間和5min內(nèi)進(jìn)入暗室的次數(shù)作為學(xué)習(xí)成績，24h后再次進(jìn)行測試作為記憶成績，并對(duì)其進(jìn)行智障評(píng)分(不進(jìn)入者評(píng)為0分，兩耳通過圓孔評(píng)為1分，前肢越過圓孔評(píng)為2分，全身進(jìn)入者評(píng)為3分)。

1.3 給藥方法及療程

按成人臨床等效量進(jìn)行換算，丹紅組采用腹腔注射丹紅注射液(由菏澤步長藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)070965)，杏丁組注射杏丁注射液(由貴州益佰制藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)070811)，每天1次，1周稱鼠重1次，并調(diào)整藥物劑量，連續(xù)腹腔注射14d。

1.4 標(biāo)本制備方法

1.4.1 NO測定 采用比色法，取血后注入試管中待凝固后用血清4℃3000r離心，取上清測定。所用測試盒由南京建成生物工程研究所提供，批號(hào)20080617。

1.4.2 ET-1測定 采用放射免疫法，取血后注入含7.5%EDTA二鈉30ul和抑肽酶40 ul的試管中混勻，4℃3000r離心10min取上清測定。所用測試盒由北京普洱偉業(yè)生物科技有限公司提供，批號(hào)20080625。

1.4.3 AChE測定 采用比色法，稱取左側(cè)大腦腦組織重量加9倍生理鹽水制成10%勻漿，3500r離心10min，取上清待測。所用測試盒由南京建成生物工程研究所提供，批號(hào)20080617。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件在Winxp系統(tǒng)下操作，對(duì)于該計(jì)量資料用(s)表示，2組間比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 VD模型大鼠行為學(xué)變化及丹紅注射液對(duì)其學(xué)習(xí)記憶能力的影響

表1、2顯示，造模前各組動(dòng)物毛發(fā)光滑，反應(yīng)良好，行動(dòng)敏捷，造模后開始出現(xiàn)興奮不安、短暫驚厥、呼吸減慢;術(shù)后早期出現(xiàn)毛發(fā)稀疏且無光澤，反應(yīng)遲鈍，運(yùn)動(dòng)減少，后肢呈“八字”，共濟(jì)失調(diào)，爬行不穩(wěn)，眼瞼明顯下垂，術(shù)后3d各組大鼠大部分活動(dòng)增加(造模中動(dòng)物死亡2只);給藥后，異常的行為均有不同程度的緩解，如毛發(fā)、行動(dòng)、較前均有改善，而模型組大鼠毛發(fā)干枯、呆滯及行為遲緩。

表1 各組大鼠造模后避暗試驗(yàn)學(xué)習(xí)記憶功能結(jié)果(s)

表1 各組大鼠造模后避暗試驗(yàn)學(xué)習(xí)記憶功能結(jié)果(s)

注:*與假手術(shù)組比較:P<0.05，**P<0.01

組 別n 學(xué)習(xí)功能 記憶功能潛伏期(s)錯(cuò)誤次數(shù)(次)潛伏期(s)錯(cuò)誤次數(shù)(次)智障評(píng)分假手術(shù)組 12 104.67±9.88 2.17±1.34 122.58±9.79 1.75±0.75 1.42±0.78手 術(shù) 組 34 43.44±12.62** 3.09±1.29* 42.22±12.11** 2.75±1.43* 1.97±0.80*

表2 各組大鼠給藥后避暗試驗(yàn)學(xué)習(xí)記憶功能結(jié)果(s)

表2 各組大鼠給藥后避暗試驗(yàn)學(xué)習(xí)記憶功能結(jié)果(s)

注:*與假手術(shù)組比較:P<0.05，**P<0.01;△與模型組比較:P<0.05，△△P<0.01;▲▲與杏丁組相比P<0.01

組 別 n 學(xué)習(xí)功能 記憶功能潛伏期(s)錯(cuò)誤次數(shù)(次)潛伏期(s)錯(cuò)誤次數(shù)(次)智障評(píng)分假手術(shù)組 12 106.83±11.39 2.08±0.79 115.00±13.82 1.58±0.67 0.50±0.67模 型 組 12 49.58±11.21** 3.17±1.40* 52.50± 9.60** 4.0 ±1.21** 1.75±0.75**杏 丁 組 11 60.09±11.61△ 2.00±0.89△ 69.27±15.50△△ 1.91±0.83△△ 0.64±0.81△△丹 紅 組 11 74.45±10.88△△▲▲ 1.91±0.83△ 75.73± 7.76△△ 1.64±0.81△△ 0.82±0.75△△

2.2 丹紅注射液對(duì)VD模型大鼠血清NO、ET-1及腦組織AChE含量的影響

表3 各組大鼠血清NO、ET-1及腦組織AChE含量的比較(s)

表3 各組大鼠血清NO、ET-1及腦組織AChE含量的比較(s)

注:*與假手術(shù)組比較:P<0.05，**P<0.01;△與模型組比較:P<0.05，△△P<0.01

組 別 n NO(μmol/l)ET-1(pg/ml)AChE(U/mgprot)12 13.517±1.78 94.493± 8.23 0.969±0.40模 型 組12 11.900±1.19* 152.282±14.47** 2.930±0.71**杏 丁 組11 13.936±1.62△△ 128.121±13.21△△ 1.427±0.36△△丹 紅 組11 13.636±2.30△ 132.288±18.63△△ 1.841±0.82假手術(shù)組△△

3 討論

NO和ET主要是由內(nèi)皮細(xì)胞合成釋放的具有代表性的舒張血管因子和收縮血管因子組成，廣泛參與心腦血管的病理生理過程，二者的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)維持血管舒縮功能和血液流動(dòng)性等具有重要意義[3～5]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組較假手術(shù)組血中 NO含量明顯降低，內(nèi)皮素水平明顯升高，提示腦缺血再灌注損傷誘發(fā)血管內(nèi)皮功能紊亂，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞合成與分泌功能障礙，此時(shí)NO的合成、釋放減少，其內(nèi)皮保護(hù)作用和拮抗作用削弱，內(nèi)皮素含量增加，使血管強(qiáng)烈收縮，腦組織血供減少，加速腦組織損傷過程。經(jīng)過藥物治療后血清NO濃度增加，ET水平降低可能與丹紅注射液使NO的合成、釋放增加，內(nèi)皮合成、釋放內(nèi)皮素減少從而改善內(nèi)皮功能有關(guān)。

腦組織海馬區(qū)乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)含量的持續(xù)降低，可能是VD發(fā)生、發(fā)展的重要原因之一。實(shí)驗(yàn)及臨床研究表明，抗膽堿治療方法對(duì) VD有效，患者腦脊液中Ach水平顯著下降，下降幅度與癡呆程度成正相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，反復(fù)腦缺血再灌注所致血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能明顯障礙，腦組織中乙酰膽堿含量升高。根據(jù)乙酰膽堿合成反應(yīng)的質(zhì)量作用規(guī)律，缺血缺氧時(shí)能夠誘發(fā)膽堿能神經(jīng)元變性壞死，導(dǎo)致神經(jīng)元內(nèi) AChE釋放，使組織中的可溶性AChE含量及活性升高，最終分解突觸內(nèi)的Ach，導(dǎo)致Ach水平進(jìn)一步降低，加重學(xué)習(xí)記憶功能的損傷。從本研究結(jié)果看，在降低AchE方面，杏丁稍優(yōu)于丹紅，二者之間比較差異無顯著性。但從總體改善記憶作用方面看，丹紅組優(yōu)于杏丁組，表明丹紅改善記憶的機(jī)制可能不只降低AchE 1個(gè)環(huán)節(jié)，而是通過多重機(jī)理發(fā)揮作用。杏丁注射液主要成分為銀杏總黃酮和雙嘧達(dá)莫，具有擴(kuò)張血管、改善腦缺血產(chǎn)生的癥狀和記憶功能障礙的作用。銀杏葉制劑是目前國內(nèi)外公認(rèn)的治療VD有效藥物，故選為對(duì)照藥物。丹紅注射液主要成分為丹參和紅花，功能活血化瘀、通脈舒絡(luò)，主要用于瘀血閉阻所致的胸痹心痛、中風(fēng)?，F(xiàn)代藥理研究表明，丹參水溶性成分為多酚羥基類化合物，具有抗血小板聚集、抗血栓形成、改變血液黏滯性、改善微循環(huán)、抗氧化損傷、擴(kuò)張血管等作用[7]。紅花主要成分為黃酮類化合物，可明顯改善腦缺血大鼠的行為障礙，縮小缺血區(qū)范圍，對(duì)缺血性腦損傷有明顯的保護(hù)作用[8]。兩藥合用可明顯改善腦的有氧代謝，擴(kuò)張血管，加速血流，使血流量增加而改善微循環(huán)，降低血液的黏滯性，增加氧運(yùn)，減輕缺血再灌注損傷[9]。

[1]王蕊，楊秦飛，唐一鵬，等.大鼠擬“血管性癡呆”模型的改進(jìn)[J].中國病理生理雜志，2000，16(10):914.

[2]徐叔云主編.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].2版.北京:人民衛(wèi)生出版社，1991.660.

[3]金惠銘，盧建，殷蓮華.細(xì)胞分子病理生理學(xué)[M].鄭州:鄭州大學(xué)出版社，2002.225-230.

[4]陳修，陳維洲，曾貴云.心血管藥理學(xué)[M].3版，北京:人民衛(wèi)生出版社，2002.192-235.

[5]邵福愿，王宇卉.分子神經(jīng)藥理學(xué)[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2005.337-347.

[6]Tanaka K，Ogawa N，Asanuma M，Kondo Y，Nomura M.Relationship ween cholinergic dysfunction and discrimination learning disabilities in Wistar rats following chronic cerebral hypoperfusion[J].Brain Res，1996，729:55-65.

[7]中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所中草藥現(xiàn)代研究(第2卷)[J].北京:北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1996.472.

[8]戎惠珍.紅花的化學(xué)成分及藥理研究概況[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1997，9(4):45.

[9]肖志輝.速避凝聯(lián)合丹參治療頑固性不穩(wěn)定型心絞痛療效觀察[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2007，4(3):69.