中藥藥性實驗檢測方法的探索和建立

方肇勤，管冬元，潘志強，盧文麗，茍 薇，丁善萍，張園園，王艷明

(上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203)

中藥藥性主要指中藥的寒熱溫涼特性，亦稱四氣，是中醫(yī)對復(fù)雜中藥藥效的高度概括，是臨床遣方用藥的依據(jù)，也是中藥的特色和標(biāo)志。當(dāng)前，在中藥研發(fā)中突出的問題之一是難以評價中藥的藥性。長期以來，由于缺乏中藥藥性標(biāo)準(zhǔn)化的檢測方法，帶來了系列學(xué)術(shù)問題，諸如一些常用中藥歷代藥性描述存在分歧，許多民間草藥、地方草藥缺少藥性的記載，中藥活性成分、有效成分組群、藥效物質(zhì)等難以明確其藥性等等，限制了中藥學(xué)的發(fā)展。因此，探索和建立標(biāo)準(zhǔn)化的中藥藥性檢測方法，已成為當(dāng)代中醫(yī)藥的關(guān)鍵科學(xué)問題和重大基礎(chǔ)問題。最近，我們在大鼠和小鼠標(biāo)準(zhǔn)化診法和辨證方法建立的基礎(chǔ)上，綜合采用不同大鼠和小鼠模型，比較和觀察了一些代表性的中藥、中藥復(fù)方、中藥有效成分給藥后對被試動物證候的影響，探索和發(fā)展中藥藥性實驗檢測方法學(xué)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 動物 雄性昆明種小鼠、雄性Wistar大鼠。

1.1.2 藥物 (1)中藥飲片:黃柏、梔子、苦參、生曬參、制附子、知母、生大黃、生黃芪、淫羊藿、制吳茱萸;(2)中藥復(fù)方:黃連解毒湯、療本滋腎丸、大黃附子湯、左金丸、參附湯、吳茱萸湯;(3)中藥有效成分:小檗堿、大黃酚、大黃素、梔子苷、知母皂苷、淫羊藿苷、烏頭堿。

1.1.3 大鼠和小鼠診法工作站 參考有關(guān)文獻[1、2]。

1.2 主要方法

1.2.1 不同證候造模 依據(jù)有關(guān)文獻[3、4]，分別采用酵母發(fā)熱大鼠造模、優(yōu)甲樂內(nèi)熱小鼠造模、環(huán)磷酰胺虛寒小鼠造模等。

1.2.2 實驗分批進行 (1)不同中藥飲片及復(fù)方連續(xù)給藥3 d后對正常小鼠證候影響的觀察;(2)不同中藥飲片及復(fù)方一次性給藥2 h后對優(yōu)甲樂內(nèi)熱造模小鼠證候影響的觀察;(3)不同中藥飲片及復(fù)方一次性給藥3 h后對酵母發(fā)熱造模大鼠證候影響的觀察;(4)不同中藥飲片及復(fù)方連續(xù)給藥3 d后對環(huán)磷酰胺虛寒造模小鼠證候影響的觀察;(5)中藥有效成分及對應(yīng)中藥飲片一次性給藥2 h后對優(yōu)甲樂內(nèi)熱造模小鼠的證候影響的觀察。

1.2.3 大鼠和小鼠標(biāo)準(zhǔn)化診法和辨證方法 依據(jù)有關(guān)文獻[1、2]。

1.2.4 統(tǒng)計方法 采用SPSS11.0軟件，對用藥后/用藥前檢測值做方差分析。

1.2.5 綜合以上實驗結(jié)果，探索和構(gòu)建中藥藥性實驗檢測方法。

2 結(jié)果

2.1 部分實驗結(jié)果

(1)酵母混懸液皮下注射6 h后，大鼠(對照組)體溫明顯升高。大黃具有一定的糾正作用，提示該藥性寒，而知母、淫羊藿未見明顯的影響(圖1);(2)優(yōu)甲樂灌胃3 h后，小鼠(對照組)體溫有一過性回升。大黃、知母性寒，有不同程度的糾正作用，而淫羊藿未見明顯的影響。參考酵母混懸液皮下注射的陰性結(jié)果，提示知母寒性的藥效可能具有不同的針對性或選擇性(圖2);(3)灌胃物理刺激對正常小鼠腋溫有一定的影響。黃連解毒湯、大黃附子湯給藥后，腋溫有進一步下降的趨勢，提示這2個復(fù)方的藥性偏寒;而參附湯、吳茱萸湯有微弱的糾正趨勢，提示藥性偏熱(圖3);(4)對于優(yōu)甲樂內(nèi)熱小鼠而言，梔子苷與梔子、淫羊藿苷與淫羊藿的藥效趨勢一致，提示兩者確為這些生藥的主要成分，且寒溫藥性一致(圖4);(5)一些熱性中藥如吳茱萸、附子未見促進體溫升高的作用，甚至反而下降，提示其熱性主要來自于口感和消化道溫?zé)岣杏X，與體溫?zé)o涉。

2.2 中藥藥性實驗檢測方法學(xué)

綜合以上實驗及有關(guān)研究進展，中藥藥性實驗檢測方法主要包括以下內(nèi)容。

圖1 酵母發(fā)熱大鼠造模及藥性檢測

圖2 優(yōu)甲樂內(nèi)熱小鼠造模及藥性檢測

圖3 正常小鼠及中藥復(fù)方藥性檢測

圖4 優(yōu)甲樂內(nèi)熱小鼠及中藥飲片和中藥成分比較

2.2.1 實驗動物 (1)原則:采用大鼠、小鼠等多品系動物綜合實驗，避免僅采用單一品系的實驗動物;(2)小鼠。昆明種小鼠首選，其優(yōu)點是價廉、溫順、個體差異均衡，缺點是不易出現(xiàn)發(fā)熱反應(yīng)、易于陽虛，其他品系小鼠如ICR、C57BL/6、Balb/c等可以采用或替代;(3)大鼠。Wistar大鼠首選，該品系大鼠酵母發(fā)熱造模成模率高，是模擬外感熱病發(fā)熱與清熱或泄熱藥理檢測的理想模型;(4)其他實驗動物。豚鼠、家兔等實驗動物均有各自的優(yōu)勢，可以探索。

2.2.2 動物模型的選擇 (1)原則:采用多模型實驗動物的綜合實驗，避免僅采用單一模型的實驗動物;(2)正常動物。模擬正常自愿受試者，觀察用藥后的寒熱反應(yīng);(3)酵母發(fā)熱大鼠模型。模擬外感熱病患者。我國幾千年來危害最大的是傳染性熱病，如傷寒和溫病。藥性寒熱主要以此作為判斷標(biāo)準(zhǔn);(4)其他模型。如優(yōu)甲樂內(nèi)熱模型、環(huán)磷酰胺虛寒模型，還可以嘗試比較和篩選其他模型，以期獲得最佳模型并模擬臨床實際。我們的研究發(fā)現(xiàn)，一是優(yōu)甲樂灌胃急性內(nèi)熱小鼠模型，造模3 h后體溫有一過性升高，誘導(dǎo)熱像不十分典型。該模型給藥、檢測時間間隔短、操作較為困難;二是環(huán)磷酰胺虛寒模型，是一個氣血陰陽具虛的毒副作用模型，藥物糾正比較難;三是回顧文獻以及結(jié)合臨床實際，可選擇和發(fā)展適宜的模型，諸如自身免疫性疾病模型、代謝障礙模型等有廣闊的發(fā)展空間。

2.2.3 動物實驗設(shè)計原則 (1)大鼠、小鼠等實驗動物綜合運用，以及多種模型綜合運用、綜合比較及分析被檢藥物的藥性，期望檢測出某藥藥性具體體現(xiàn)在哪些方面，避免單一動物和模型所帶來的偏差;(2)控制樣本規(guī)模，重復(fù)實驗。樣本過大會造成實驗操作困難、增加操作誤差，因此可以縮減每批實驗的樣本數(shù)，并重復(fù)2、3次實驗，進行結(jié)果綜合分析。

2.2.4 分組設(shè)計 (1)正常對照組、模型組與各實驗組;(2)灌胃純水的正常和模型對照組。灌胃會對大鼠和小鼠證候產(chǎn)生一定的影響，因此應(yīng)設(shè)灌胃純水對照組，并以該組數(shù)據(jù)均數(shù)作為基數(shù)，所有數(shù)據(jù)與此基數(shù)比值并運算;(3)陽性藥性藥物對照藥。作為寒熱藥性的標(biāo)準(zhǔn)，可選擇一些藥性覆蓋面廣、比較穩(wěn)定的藥物，如寒性藥梔子、大黃等。

2.2.5 動物的標(biāo)準(zhǔn)化診法與辨證 (1)設(shè)備和方法參見有關(guān)文獻[1，2];(2)診法檢測指標(biāo):腋溫、眼紅外溫度、尾紅外溫度及爪、尾、舌等顯微數(shù)碼拍照，提取反映紅色程度的r值及體重、攝食量、飲水量和抓力、跨格數(shù)、站立數(shù)，;并計算出曠場、紅色程度、體溫等;(3)診法檢測時間點為用藥前或用藥后。一些長時程實驗可以檢測至自然恢復(fù)后。用藥后檢測點，應(yīng)依據(jù)被試藥物的藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)，預(yù)計寒熱藥性發(fā)揮作用的時間確定，通常應(yīng)開展預(yù)實驗;(4)實驗人員應(yīng)經(jīng)過嚴格培訓(xùn)以及熟練和認真操作，以減少操作誤差。

2.2.6 實驗流程 (1)依據(jù)文獻和預(yù)初實驗，確定各初診、造模、用藥持續(xù)時間和時間點、用藥后檢測時間等，制定詳細的實驗方案;(2)購入實驗動物常規(guī)進行飼養(yǎng);(3)預(yù)檢測，令實驗動物習(xí)慣于診法工作站及檢測，以避免正式實驗后可能帶來的干擾(體檢對于小鼠等實驗動物是異常額外刺激，可能會造成恐懼和由此帶來的檢測數(shù)據(jù)失真);(4)造模前全套體檢;(5)造模及用藥;(6)用藥起效后全套體檢;(7)必要時增加恢復(fù)后全套體檢;(8)數(shù)據(jù)分析。

2.2.7 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計的一些要求 (1)數(shù)據(jù)的權(quán)重。一些檢測數(shù)據(jù)的權(quán)重應(yīng)依據(jù)其檢測的靈敏度、穩(wěn)定性以及實驗動物的特點調(diào)整，四診合參。如①體溫=各動物腋溫/對照組均數(shù) ×0.5(～0.7)+各動物眼紅外溫/對照組均數(shù)×0.4(～0.2)+各動物尾根部紅外溫/對照組均數(shù) ×0.1;②紅色程度 =各動物爪r值/對照組均數(shù)×0.7+各動物尾 r值/對照組均數(shù)×0.3(C57等黑色小鼠尾r權(quán)重可降低)。(2)分析數(shù)據(jù)間的關(guān)系。一些數(shù)據(jù)間的關(guān)系值得關(guān)注，如眼紅外測溫(體內(nèi)溫度)與尾根部紅外測溫等其他體表溫度檢測。仔細分析可能有利于判斷陽氣內(nèi)斂、陽氣體內(nèi)外分布;(3)數(shù)據(jù)統(tǒng)計與統(tǒng)計意義。鑒于大多中藥對實驗動物證候的影響不是十分顯著，且易被灌胃和體檢等額外刺激所干擾，因此得到具有統(tǒng)計意義的結(jié)果往往比較難，需要放大樣本量，而后者會給實驗帶來困難，放大檢測誤差。因此，重復(fù)觀察其數(shù)據(jù)趨勢而不是苛求，其統(tǒng)計意義可能更具有可操作性，更為合理。

2.2.8 自愿受試者 (1)中藥藥性的判斷，部分來自自愿受試者對藥物的口感、皮膚感覺、消化道感覺，如溫、熱、辣、涼爽等，五味檢測尤其如此。這些感受動物實驗難以檢測，因此應(yīng)招募自愿受試者;(2)五味檢測應(yīng)采用盲法和氣味刻度記錄表，濃淡級別以文字細致刻畫;采用0.5g生藥/ml的藥液(藥物有效成分和有效部位依據(jù)其得率換算)，多人同步比較多味藥物，互為對照，填表并量化評價，實驗結(jié)束后統(tǒng)計分析;(3)傳統(tǒng)中藥飲片可以直接品嘗，而新藥則應(yīng)在毒理評價安全的基礎(chǔ)上進行。

3 討論

3.1 中藥藥性評價具有廣泛的需求

(1)目前臨床常用中藥的藥性描述歷代多有分歧。如人參其藥性分別有平、微溫、溫、微涼、微寒等不同描述;又如蒲公英，其藥性分別有平、微寒、寒等不同描述[5-7]。出現(xiàn)以上的分歧，究其原因可能與中藥的產(chǎn)地、品種、炮制等因素有關(guān)，也可能與藥性評價的方法差異有關(guān)。比如蒲公英在治療外感熱病中體現(xiàn)出寒性的藥性，而作為常人的菜肴多未見寒性。因此，在產(chǎn)地、炮制等明確的情況下，進一步檢測常用中藥藥性是必要的;(2)中藥研發(fā)工作的需要。民間草藥、地方草藥是中藥發(fā)展的源泉，而當(dāng)代分離與提取的中藥活性成分、有效成分組群、藥效物質(zhì)，以及中藥復(fù)方新制劑是中藥學(xué)發(fā)展的方向，這些中藥的藥性有待明確;(3)中醫(yī)臨床的廣泛需求。當(dāng)代的疾病譜發(fā)生了根本性的改變，以病原微生物感染導(dǎo)致的熱性病、寒性病減少了，臨床上以內(nèi)傷雜病、難治病、不治病為主，病性、證候的內(nèi)涵發(fā)生了改變。這就對藥性的界定提出了新的要求:歷代依據(jù)病原微生物感染寒、熱病為主所建立的藥性，在很大程度上需要再界定、再評價及豐富認識，以指導(dǎo)臨床用藥，滿足中醫(yī)臨床日益增長的需求;(4)中醫(yī)基礎(chǔ)理論發(fā)展的需求。藥性、證候、病機、藏象理論等之間存在著密切有機的聯(lián)系，藥性的問題不解決，驗證和發(fā)展中醫(yī)基礎(chǔ)理論便會困難;(5)中藥學(xué)科自身發(fā)展和完善的需求。藥性作為中藥的基本屬性，中藥學(xué)科的發(fā)展需要予以界定、規(guī)范并指導(dǎo)應(yīng)用。

3.2 中藥藥性的由來

歷史上，中藥藥性是從藥物作用于機體所發(fā)生的反映概括出來的[5]。所謂“療寒以熱藥”、“療熱以寒藥”主要通過兩個途徑:正常人服用中藥后產(chǎn)生寒熱溫涼的感受和證候表現(xiàn)，以及不同證候患者服用中藥后產(chǎn)生的藥效。值得注意的是，一些可以糾正因感染而出現(xiàn)寒熱證候的藥物，對正常人可能沒有寒熱作用;而對正常人產(chǎn)生寒熱證候的中藥，對外感熱病也可能沒有寒熱的影響。因此，藥性是通過多途徑評價而日積月累逐漸形成的。

藥性寒熱溫涼評價主要依據(jù)的4類證候:(1)寒象與熱象。如用藥后出現(xiàn)畏寒、形寒、喜熱飲等藥性為寒，發(fā)熱、升火、怕熱為熱;以及局部寒熱感受，如體溫和體表溫度等;(2)顏色。如面、唇、舌、指甲等青紫淡白為寒，紅色為熱;分泌物、排泄物、舌苔等黃色為熱;(3)動靜緩速。如脈遲緩為寒，脈數(shù)為熱等;(4)干燥與濕潤等津液多少。如分泌物、排泄物清長為寒，干燥為熱。

3.3 中藥藥性的實驗檢測探索

上個世紀中葉，學(xué)術(shù)界開始了中醫(yī)證候物質(zhì)基礎(chǔ)的研究，在采用寒或熱的中藥證候造模的基礎(chǔ)上，涉及中藥藥性的實驗檢測[8]等。例如有人采用干姜灌胃大鼠造模，黃連等藥物反證法研究中藥藥性[9]，也有人采用知母石膏湯、附子干姜湯灌胃大鼠觀察其藥性[10]。還有人觀察干姜、黃芩等灌胃前、后大鼠紅外熱成像特征[11、12]等。而新近發(fā)展并趨于成熟的大鼠和小鼠標(biāo)準(zhǔn)化診法與辨證方法[1、2]，給藥性判斷提供了標(biāo)準(zhǔn)化、計量化的方法學(xué)保障。鑒此，我們提出了建立和發(fā)展中藥藥性評價平臺的假說[13]。通過本實驗的系統(tǒng)研究，該假說得到了進一步的驗證，并充分暴露了藥性實驗檢測特點、效能和存在的問題等，給中藥藥性實驗檢測方法的完善和實用奠定了基礎(chǔ)。

3.4 結(jié)論

(1)中藥、中藥復(fù)方和中藥主要成分以及新的動、植物藥，甚至是常用有效西藥的藥性，是可以被檢測和準(zhǔn)確刻畫的;(2)“藥物-生物效應(yīng)”的藥性檢測，是在繼承中醫(yī)理論與實踐的基礎(chǔ)上，綜合正常、證候、疾病等實驗動物(大鼠、小鼠為主)，檢測被檢藥物給藥后所引發(fā)不同層次的生物效應(yīng)。該技術(shù)采用大鼠和小鼠標(biāo)準(zhǔn)化、計量化的設(shè)備、方法與技術(shù);(3)“藥物-生物效應(yīng)”密切關(guān)聯(lián)的研究，是藥性實驗檢測方法學(xué)的核心。通過該研究，可以充分、準(zhǔn)確地刻畫被檢藥物的藥性;(4)受到實驗動物特點的限制，部分藥性的檢測仍應(yīng)采取自愿受試者評價的方式;(5)中藥藥性實驗檢測方法的發(fā)展趨勢:①不斷篩選和建立多樣化的適宜證候模型，以涉及藥性可能體現(xiàn)的大多途徑;②不斷篩選最為適宜評價藥性的小鼠、大鼠等不同品系的實驗動物;③擴大檢測中藥的范圍，有助于充分暴露存在的技術(shù)問題并不斷完善藥性檢測實驗技術(shù);④可以嘗試被試藥物制劑滴眼刺激兔眼結(jié)膜血管擴張實驗、大鼠和小鼠胃黏膜病理觀察、大鼠和小鼠飲食量和糞便質(zhì)量觀察等方法，探索和發(fā)展人類口感和消化道灼熱感等檢測替代方法。

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