外源性血栓粒徑對(duì)大鼠腦血栓損傷的影響

張恒艾，高 梅，時(shí)麗麗，陳柏年，于曉彥，杜冠華

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院·北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，國(guó)家藥物篩選中心北京 100050)

中風(fēng)是目前導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一，腦缺血一直是醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)［1］。缺血性中風(fēng)占中風(fēng)的87%，而血栓栓塞是引起缺血性中風(fēng)的重要原因，因此，大鼠血栓栓塞性中風(fēng)模型是研究缺血性中風(fēng)比較理想的動(dòng)物模型。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，腦內(nèi)注射栓子可導(dǎo)致栓塞性中風(fēng)，多種人工制備的栓子如同種異體血栓、凝血酶、銀質(zhì)微球、膽固醇結(jié)晶和聚乙烯微球等不同材質(zhì)的栓子用于制備栓塞性中風(fēng)動(dòng)物模型，對(duì)于栓子的大小和注入量的多少也有報(bào)道［2-5］，但對(duì)于栓塞的大小目前還缺乏統(tǒng)一，關(guān)于栓子粒徑與大鼠腦損傷的相關(guān)性也未見報(bào)道。

同種異體血液自發(fā)性形成的血栓制備動(dòng)物腦缺血模型具有明顯的優(yōu)勢(shì)，并有報(bào)道指出，tPA可使自發(fā)形成的血栓造成的栓塞迅速再灌，但不能使采用凝血酶制備的栓子形成的栓塞迅速再灌［6］。因此，為了制備適合于評(píng)價(jià)藥物作用的腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ停疚牟捎米园l(fā)形成的3種不同粒徑同種異體血栓經(jīng)頸外動(dòng)脈注射方法制備腦缺血模型，并研究血栓粒徑對(duì)大鼠腦損傷的影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物模型與分組♂SD大鼠52只，體質(zhì)量250～300 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。控制室溫23℃ ～25℃，自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)3 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分成正常組(normal，n=10)，假手術(shù)組(sham，n=10)，大粒徑模型組(D=150～178 μm，Group L，n=11)，中粒徑模型組(D=74～124 μm，Group M，n=12)和小粒徑模型組(D=48 ～74 μm，Group S，n=9)。

1.2儀器普通倒置顯微鏡(型號(hào)XDS-1B，重慶光學(xué)儀器廠)，SR-6N立體定位儀(Narishige)，激光多普勒血流儀(Laser Doppler Flowmetry，LDF)系統(tǒng)，正置顯微鏡(COIC XSZ-HS3，重慶光學(xué)儀器廠)，照相機(jī)(型號(hào)Cannon E05 450D，日本佳能公司)。

1.3血栓制備參考Kaneko等的方法略加改進(jìn)，10 ml血液取自2只同種同批次SD大鼠，37℃自然干燥，用研缽研碎后經(jīng)80目(178 μm)，100目(150 μm)，120 目(124 μm)，200 目(74 μm)和 300 目(48 μm)細(xì)胞篩過(guò)篩，得到3個(gè)直徑在150～178 μm，74～124 μm 和 48 ～74 μm 范圍粒徑的血栓，應(yīng)用時(shí)15 mg血栓加0.5 ml生理鹽水配制成濃度為30 g·L-1混懸液。普通倒置顯微鏡拍照(Fig 1)。

1.4模型的制備動(dòng)物以水合氯醛(0.4 mg·g-1，ip)麻醉，鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery，CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery，ICA)和頸外動(dòng)脈(external carotid artery，ECA)近心端，并于近心端游離一段頸外動(dòng)脈約0.5 cm。將頸外動(dòng)脈游離端拉至與頸內(nèi)動(dòng)脈成一條直線，并在頸外動(dòng)脈處剪口，1ml注射器逆行注入30g·L-1血栓生理鹽水混懸液0.5 ml后，立即結(jié)扎頸外動(dòng)脈，同時(shí)開放頸總動(dòng)脈夾，使血栓通過(guò)頸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)入顱內(nèi)至大腦各動(dòng)脈，造成多灶性血栓栓塞性中風(fēng)模型。栓塞過(guò)程中動(dòng)物保持麻醉狀態(tài)，用普通臺(tái)燈(100 W)照射，術(shù)后用電熱毯，以保持動(dòng)物體溫在37℃。假手術(shù)組頸外動(dòng)脈注射生理鹽水，正常組不進(jìn)行任何手術(shù)操作。

Fig 1 Suspension of homologues blood emboli in normal saline

1.5腦血流檢測(cè)采用多普勒血流儀動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)大鼠的局部腦血流，分別測(cè)定假手術(shù)組和3種粒徑模型組大鼠注入生理鹽水和血栓后相對(duì)腦血流變化，每組測(cè)4只大鼠。方法如下，用10%水合氯醛(0.4 mg·g-1，ip)麻醉大鼠，將大鼠固定在定位儀上，剪開頭頂部皮膚，酒精棉擦拭，暴露出前囟。以前囟為坐標(biāo)原點(diǎn)，選取前囟后1 mm，右側(cè)2 mm為測(cè)定點(diǎn)，定位并固定好探頭座。穩(wěn)定LDF讀數(shù)后記錄10 min內(nèi)血流值，以其平均值作為腦血流的基礎(chǔ)值。每只大鼠的腦血流以血栓注入后測(cè)得值占腦血流基礎(chǔ)值的百分率即相對(duì)腦血流(relative regional cerebral blood flow，rCBF)表示，連續(xù)監(jiān)測(cè)60 min，選取血栓注入完畢后 0、10、20、30、40、50 和 60 min 血流值做統(tǒng)計(jì)。

1.6神經(jīng)行為學(xué)檢查分別于動(dòng)物手術(shù)24 h后采用Bederson’s評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［7］進(jìn)行評(píng)分。提鼠尾離開地面約1尺，觀察兩前肢狀況;將大鼠置于水平地面，推動(dòng)其雙肩，觀察兩側(cè)抵抗力有無(wú)差異;大鼠置于地面，觀察其行走情況。采用五級(jí)評(píng)分法(0～4分)，分?jǐn)?shù)越高，說(shuō)明其神經(jīng)行為損傷越嚴(yán)重。①行為完全正常者，記0分;② 提起鼠尾離開地面，手術(shù)對(duì)側(cè)前肢內(nèi)旋、內(nèi)收者，記1分;③ 大鼠至地面，用手?jǐn)D壓兩側(cè)檢查其抗力，手術(shù)對(duì)側(cè)抗力下降者，記2分;④大鼠至地面，觀察其行走，圍繞手術(shù)對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈者，記3分;⑤ 損傷極其嚴(yán)重，已無(wú)法自主活動(dòng)者，記4分。

1.7HE染色手術(shù)后24 h，動(dòng)物以水合氯醛(0.4 mg·g-1，ip)麻醉，4%多聚甲醛經(jīng)心灌流固定，取出腦組織，經(jīng)石蠟包埋，4 μm厚切片進(jìn)行HE染色，顯微鏡下拍照觀察。

1.8數(shù)據(jù)處理各個(gè)時(shí)間點(diǎn)相對(duì)腦血流組間比較和神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分的組間比較采用SPSS10.0軟件的one-way ANOVA進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。

2 結(jié)果

2.1血栓粒徑對(duì)大鼠局部腦血流的影響激光多普勒血流儀的原理是動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)微血管中紅細(xì)胞的行為特征，主要反映微血管的功能狀況。假手術(shù)組大鼠大腦皮層的rCBF基本保持穩(wěn)定，模型組大鼠注入3種粒徑血栓后rCBF迅速降低，分別使rCBF降到 14.4%、29.9%和 22.0%，與假手術(shù)組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，rCBF逐步升高，10 min時(shí)，rCBF分別升高到 16.2%(P＜0.05)，38.3%和 49.6%，60 min 時(shí)，rCBF 分別升高到37.7%，40.2%和60.2%(Fig 2)。表明腦血流的降低程度與血栓粒徑基本呈正相關(guān)。

Fig 2 Changes of rCBF after injection of different sizes of blood emboli for 1 h in rats(±s，n=4)

2.2血栓粒徑對(duì)大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分的影響術(shù)后24 h神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組和正常組相比，3個(gè)粒徑血栓均能造成大鼠明顯的神經(jīng)行為學(xué)障礙，模型組大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分(2.55±0.69)，升高(Tab 1，P＜0.05)。大粒徑組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分高于中粒徑組(1.75±1.14)和小粒徑組(1.67 ±0.87)(P＜0.05)，中粒徑組和小粒徑組相比差異無(wú)顯著性。

Tab 1 Neurological deficit scores of rats with injection of different size of homologues blood emboli at 24 h(±s，n=9～12)

Tab 1 Neurological deficit scores of rats with injection of different size of homologues blood emboli at 24 h(±s，n=9～12)

＊＊P ＜0.01 vs sham;#P ＜0.05 vs group L

Group Neurological deficit scores Normal 0 Sham 0 L 2.5455 ±0.2180＊＊M 1.7857 ±0.2759＊＊#S 1.7000 ±0.2494＊＊#

2.3血栓粒徑對(duì)大鼠皮層神經(jīng)元損傷的影響HE染色發(fā)現(xiàn)，正常組及假手術(shù)組大鼠皮層組織結(jié)構(gòu)致密，神經(jīng)細(xì)胞分層清晰，無(wú)腫脹，核深染。頸外動(dòng)脈注入3種粒徑血栓混懸液均能夠引起大鼠彌漫的，散在的皮層損傷，大粒徑組和中粒徑大鼠梗死區(qū)皮層組織結(jié)構(gòu)疏松呈網(wǎng)篩狀，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目減少，排列無(wú)規(guī)則，神經(jīng)元脫失嚴(yán)重，神經(jīng)細(xì)胞腫脹明顯，小粒徑組大鼠梗死區(qū)皮層神經(jīng)元發(fā)生明顯缺血性改變，神經(jīng)細(xì)胞核固縮明顯。見Fig 4。

3 討論

血栓栓塞模型優(yōu)勢(shì)在于極好的模擬人類腦血栓栓塞性中風(fēng)的發(fā)生發(fā)展，對(duì)于溶栓藥物的開發(fā)具有重要的意義。近30年來(lái)科研工作者不斷的嘗試腦內(nèi)注射不同栓子觀察對(duì)動(dòng)物腦損傷的影響(Tab 2)，但關(guān)于栓子粒徑大小對(duì)腦損傷影響的比較研究并不多。我們知道，血栓注入腦內(nèi)經(jīng)過(guò)不同直徑大小的血管，引起不同腦區(qū)血流阻斷，進(jìn)而引發(fā)不同部位腦區(qū)梗死和動(dòng)物行為學(xué)障礙。

本實(shí)驗(yàn)選取3種粒徑的同種異體血栓，大粒徑(150 ～178 μm)，中粒徑(74 ～ 124 μm)和小粒徑(48～74 μm)，以大鼠能承受的較大的溶劑體積(0.5 ml)和血栓質(zhì)量(15 mg)制備大鼠血栓栓塞中風(fēng)模型，觀察血栓粒徑對(duì)大鼠腦血流，神經(jīng)行為學(xué)及腦皮質(zhì)組織結(jié)構(gòu)的影響，為制備穩(wěn)定、可靠的腦血栓栓塞性中風(fēng)模型提供依據(jù)。

外源性血栓通過(guò)頸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)入腦內(nèi)血管造成彌散性血管栓塞，使腦血流降低，神經(jīng)組織缺血缺氧，內(nèi)環(huán)境紊亂進(jìn)而引起神經(jīng)組織損傷。Henninger等［8］認(rèn)為，相對(duì)腦血流降到45%并維持10 min，則預(yù)示血栓栓塞性中風(fēng)模型制備成功。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，頸內(nèi)動(dòng)脈注入3種粒徑血栓后均使相對(duì)腦血流降到30%以下，10 min后，大粒徑組和中粒徑組仍保持在45%以下，而小粒徑組恢復(fù)到50%?？梢哉J(rèn)為，3種粒徑血栓均可引起血栓栓塞性腦梗死，且腦血流降低程度與血栓粒徑大小呈正相關(guān)關(guān)系。

神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分發(fā)現(xiàn)，3種粒徑血栓均能引起大鼠神經(jīng)行為學(xué)障礙，且神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分升高程度與血栓粒徑大小呈正相關(guān)。HE染色也提示，血栓栓塞性中風(fēng)大鼠腦病理?yè)p傷程度與血栓粒徑大小有一定的相關(guān)性。

Fig 4 Paraffin sections stained with HE showed brain cortex damage after injection of thrombli for 24 h.

Tab 2 Characteristic of emboli used in making thromboembolic model

綜上所述，頸外動(dòng)脈注射3種粒徑血栓均能引起大鼠腦血流降低，神經(jīng)行為學(xué)障礙及大腦皮層病理性損傷，其改變程度與粒徑大小基本呈正相關(guān)。不同的腦血流降低程度和神經(jīng)行為學(xué)障礙提示血栓粒徑對(duì)大鼠腦梗死情況如梗死面積可能有密切的關(guān)系，在下一步實(shí)驗(yàn)中可通過(guò)MRI或TTC染色等方法，觀察不同粒徑血栓對(duì)大鼠不同腦區(qū)梗死面積的影響，以便進(jìn)一步穩(wěn)定的腦血栓栓塞性中風(fēng)模型，為腦血栓栓塞性中風(fēng)防治提供可靠的研究平臺(tái)。

［1］侯 唏，梁 楓，李愛(ài)劍，等.銀杏葉提取物聯(lián)合依達(dá)拉奉對(duì)氣虛血瘀型腦缺血/再灌注大鼠血液學(xué)的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(8):1049-53.

［1］Hou X，Liang F，Li A J，et al.Effects of EGb combined with ED on hematology in cerebral ischemia reperfusion injury in rats with Qi deficiency and blood stasis［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(8):1049-53.

［2］Orset C，Macrez R，Young A R，et al.Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion［J］.Stroke，2007，38(10):2771-8.

［3］Molnár L，Hegedüs K，F(xiàn)ekete I.A new model for inducing transient cerebral ischemia and subsequent reperfusion in rabbits without craniectomy［J］.Stroke，1988，19(10):1262-6.

［4］Mayzel-Oreg O，Omae T，Kazemi M，et al.Microsphere-induced embolic stroke:an MRI study［J］.Magn Reson Med，2004，51(6):1232-8.

［5］Rapp J H，Pan X M，Neumann M，et al.Microemboli composed of cholesterol crystals disrupt the blood-brain barrier and reduce cognition［J］.Stroke，2008，39(8):2354-61.

［6］Niessen F，Hilger T，Hoehn M，Hossmann K A.Differences in clot preparation determine outcome of recombinant tissue plasminogen activator treatment in experimental thromboembolic stroke［J］.Stroke，2003，34(8):2019-24.

［7］Bederson J B，Pitts L H，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］.Stroke，1986，17(3):472-6.

［8］Henninger N，Bouley J，Br?atane B T，et al.Laser doppler flowmetry predicts occlusion but not tPA-mediated reperfusion success after rat embolic stroke［J］.Exp Neuro，2009，215(2):290-7.

［9］Kudo M，Aoyama A，Ichimori S，F(xiàn)ukunaga N.An animal model of cerebral infarction:homologous blood clot emboli in rats［J］.Stroke，1982，13(4):505-8.

［10］Kaneko D，Nakamura N，Ogawa T.Cerebral infarction in rats using homologous blood emboli:Development of a new experimental model［J］.Stroke，1985，16(1):76-84.

［11］Overgaard K，Sereghy T，Boysen G，et al.A rat model of reproducible cerebral infarction using thrombotic blood clot emboli［J］.J Cereb Blood Flow Metab，1992，12(3):484-90.

［12］Busch E，Krüger K，Hossmann K A.Improved model of thromboembolic stroke and rt-PA induced reperfusion in the rat［J］.Brain Res，1997，778(1):16-24.

［13］Krueger K，Busch E.Protocol of a thromboembolic stroke model in the rat review of the experimental procedure and comparison of models［J］.Invest Radiol，2002，37(11):600-8.