交叉反應(yīng)物質(zhì)197轉(zhuǎn)運(yùn)大分子物質(zhì)通過血腫瘤屏障的效果和機(jī)制

王 萍，劉云會，薛一雪

(1.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室，遼寧沈陽 110001;2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，遼寧沈陽 110004)

腦腫瘤是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病，手術(shù)切除結(jié)合術(shù)后化療能有效延長患者的生存期。然而，由于血腫瘤屏障的存在極大的限制了抗腫瘤藥物進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，影響化療療效，如何安全有效的增加血腫瘤屏障的通透性是目前亟待解決的關(guān)鍵問題［1］。交叉反應(yīng)物質(zhì) 197(cross-reacting material 197，CRM197)是一類白喉毒素的無毒突變體，作為莢膜多糖抗原載體蛋白或疫苗在國外已嘗試應(yīng)用于臨床［2-3］。CRM197的主要作用位點(diǎn)是白喉毒素受體，也稱肝素結(jié)合表皮生長因子(heparin-binding epidermal growth factor，HB-EGF)的膜結(jié)合前體。CRM197與受體結(jié)合后可以抑制受體剪切，明顯減少剪切后HB-EGF的形成，減弱由HB-EGF激活的多條信號途徑，如 PI3K/Akt信號途徑。因此，CRM197還具有抗癌的作用，可用于卵巢癌等HBEGF高表達(dá)的癌癥的治療［4-5］。最近有研究發(fā)現(xiàn)［6］，CRM197可以作為一種安全有效的載體，轉(zhuǎn)運(yùn)大分子物質(zhì)通過血腦屏障，提示CRM197有可能成為新的更為有效的腦內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體。對于CRM197轉(zhuǎn)運(yùn)大分子物質(zhì)通過血腫瘤屏障的作用效果及相關(guān)機(jī)制目前尚未見報道。本研究通過檢測分析CRM197轉(zhuǎn)運(yùn)HRP通過血腫瘤屏障的效果以及對p-Akt、轉(zhuǎn)錄因子FOXO1A及質(zhì)膜微囊蛋白caveolin-1表達(dá)水平的影響，旨在為CRM197的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器CRM197、牛血清白蛋白購自Sigma公司;HRP偶聯(lián)試劑盒購自Alpha Diagnostic公司;EGM-2 MV細(xì)胞培養(yǎng)液購自Lonza公司;兔抗p-FOXO1A(Ser256)多克隆抗體購自Abcam公司;兔抗p-Akt 1/2/3(Ser473)多克隆抗體、羊抗Akt 1/2多克隆抗體、兔抗caveolin-1多克隆抗體、小鼠抗β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗和ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒均購自Santa Cruz公司;SP試劑盒購自福建邁新生物技術(shù)公司。主要儀器:多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices，美國);正置顯微鏡(Olympus，日本);電泳裝置(Bio-Rad，美國)。

1.2制備CRM197-HRP和BSA-HRP偶聯(lián)物按照HRP偶聯(lián)試劑盒提供的說明，將CRM197、BSA與HRP偶聯(lián)，即將1 mg CRM197或BSA溶于偶聯(lián)buffer，加入1 mg預(yù)激活的HRP，于4°C孵育過夜。加入阻斷buffer后，將混合物在室溫下孵育1 h。將偶聯(lián)物于 4°C用 PBS透析，加入穩(wěn)定 buffer，經(jīng)Sephacryl S-200 HR分離純化后，置于4°C保存。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系hCMEC/D3 由 Pierre-Olivier Couraud(INSERM U567，Paris，法國)教授惠贈，培養(yǎng)于EGM-2 MV培養(yǎng)液(按照說明書加入添加物)。人U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞由中國醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)教研室提供，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液。

1.4體外血腫瘤屏障模型的制作和跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)將hCMEC/D3細(xì)胞接種于transwell上室，培養(yǎng)3 d后，接種人U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞于transwell膜背面，共同培養(yǎng)2 d后都長至單層。經(jīng)電阻測量系統(tǒng)檢測血腫瘤屏障模型的跨內(nèi)皮電阻值為70～110 Ω·cm-2。所有的細(xì)胞培養(yǎng)于37℃的濕潤環(huán)境中(5%CO2和95%的空氣)。向transwell上室中加入10 mg·L-1CRM197-HRP分別作用不同時間，而后通過TMB顯色法檢測下室中HRP的活性變化，即向含有HRP的下室溶液中加入TMB顯色液室溫孵育20 min后，加入0.5 mol·L-1H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測HRP的光吸收值，繪制HRP的標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測CRM197-HRP的轉(zhuǎn)運(yùn)水平。對照組加入BSA-HRP(10 mg·L-1)分別作用不同時間，比較對HRP的轉(zhuǎn)運(yùn)效果。

1.5細(xì)胞免疫組化檢測hCMEC/D3細(xì)胞在EGM-2 MV細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)3 d后，替換以人U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2 d后使用。將CRM197(10 mg·L-1)作用于hCMEC/D3細(xì)胞1 h后，棄掉培養(yǎng)液，PBS洗后4℃丙酮固定，PBS洗后，按照S-P試劑盒的說明，用10%BSA封閉30 min，兔抗p-Akt一抗孵育過夜，PBS洗后，生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG孵育30 min，PBS洗后，鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶孵育20 min，PBS洗后，DAB顯色后顯微鏡觀察。

1.6Western blot實(shí)驗(yàn)hCMEC/D3細(xì)胞在EGM-2 MV細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)3 d后，替換以人U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2 d后使用。將CRM197(10 mg·L-1)作用于hCMEC/D3細(xì)胞1 h后收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑(10 g·L-1aprotinin，10 g·L-1PMSF 和 50 mmol·L-1sodium orthovanadate)。細(xì)胞提取物經(jīng)考馬斯亮藍(lán)G250結(jié)合法測定蛋白濃度，以每加樣孔10～20 μg蛋白總量經(jīng)SDS-PAGE電泳進(jìn)行分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，于4℃封閉過夜。d 2 TBST洗后，分別加入一抗室溫雜交2 h，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫雜交2 h。TBST洗后，向膜上滴加ECL工作液，進(jìn)行壓片檢測，顯影定影，獲取圖像。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間采用One-way ANOVA分析。

2 結(jié)果

2.1體外血腫瘤屏障模型中CRM197-HRP的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)效果CRM197-HRP在不同時間點(diǎn)的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，transwell下室中HRP的活性呈時間依賴性增加，均高于30 min組;CRM197-HRP作用60 min時，transwell下室中HRP的活性較前一組增加。CRM197-HRP在各時間點(diǎn)的轉(zhuǎn)運(yùn)水平均高于BSA-HRP對照組(Fig 1)。

Fig 1 Transcytosis experiments of CRM197-HRP and BSA-HRP across the in vitro BTB model(±s，n=4)

2.2CRM197抑制hCMEC/D3細(xì)胞中p-Akt的表達(dá)水平結(jié)果顯示hCMEC/D3細(xì)胞中CRM197作用前，p-Akt分布于胞質(zhì)和細(xì)胞核中，且以胞質(zhì)為主(Fig 2A);加入 CRM197作用1 h后，p-Akt的表達(dá)水平減弱(Fig 2B)。

2.3CRM197作用后p-FOXO1A、p-Akt和caveolin-1在hCMEC/D3細(xì)胞中的表達(dá)變化將CRM197或PI3K抑制劑LY294002加入hCMEC/D3細(xì)胞中作用1 h，Western blot結(jié)果顯示與未處理組相比，CRM197作用后Akt和FOXO1A的蛋白磷酸化水平下降，總Akt的蛋白表達(dá)水平未發(fā)生變化;而質(zhì)膜微囊蛋白caveolin-1的表達(dá)水平增加(Fig 3)。

3 討論

血腫瘤屏障的存在極大的限制了化療藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)，一些化學(xué)方法已嘗試用于增加血腫瘤屏障的通透性［7-8］。最近研究發(fā)現(xiàn)，CRM197能夠轉(zhuǎn)運(yùn)大分子物質(zhì)通過血腦屏障，但其轉(zhuǎn)運(yùn)大分子物質(zhì)通過血腫瘤屏障的效果和機(jī)制目前尚無文獻(xiàn)報道。本研究結(jié)果證實(shí)，CRM197能有效轉(zhuǎn)運(yùn)HRP通過血腫瘤屏障，其機(jī)制可能與減少Akt和FOXO1A的磷酸化水平，增加質(zhì)膜微囊蛋白caveolin-1的表達(dá)有關(guān)。

Fig 2 Expression and distribution of p-Akt analyzed by immunohistochemistry after treatment with CRM197 in the hCMEC/D3 cells for 1 h(±s，n=4)

Fig 3 Western blot analysis of the expressing levels of p-Akt，p-FOXO1A and caveolin-1 in extracts of hCMEC/D3 cells after treatment with CRM197(±s，n=3)

在本研究中，首先采用hCMEC/D3細(xì)胞建立了體外血腫瘤屏障模型，并以此為研究對象檢測了CRM197-HRP通過血腫瘤屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)水平。結(jié)果顯示，隨著CRM197-HRP作用時間的延長，transwell下室中HRP的活性呈時間依賴性增加;和前一組相比CRM197-HRP作用60 min時，transwell下室中HRP的活性增加，提示在30～60 min時間段CRM197-HRP的轉(zhuǎn)運(yùn)水平較高。由于未經(jīng)修飾的大分子量血漿蛋白，如白蛋白(67 ku)，很難通過血腦屏障，所以白蛋白或BSA經(jīng)常在體外或在體研究中被用來評價血腦屏障的完整性［9］。本研究中，CRM197-HRP通過血腫瘤屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)水平約為BSA-HRP的4倍，表明CRM197-HRP具有更好的轉(zhuǎn)運(yùn)效果。

Caveolae是位于細(xì)胞膜表面的特異性內(nèi)陷囊狀結(jié)構(gòu)，是第一個被確定的內(nèi)皮細(xì)胞胞吞成分，由caveolin家族蛋白成員caveolin-1，-2和-3組成。研究表明，caveolae在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用［10］。在腦組織中，caveolin-1在腦微血管，尤其在微血管內(nèi)皮細(xì)胞中有較高的表達(dá)水平［11］。caveolin-1是caveolae的標(biāo)志性蛋白，在維持caveolae的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能中起重要作用，在血腫瘤屏障跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)過程中也起著關(guān)鍵的作用。caveolin-1的表達(dá)也受到某些調(diào)控因素的影響，如FOXO轉(zhuǎn)錄因子能直接與caveolin-1啟動子區(qū)的5'-TTGTTTAC-3'位點(diǎn)結(jié)合，誘導(dǎo)caveolin-1的表達(dá)［12］。最近研究顯示，叉頭框(forkhead box，F(xiàn)OX)蛋白在內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)中起著多方面的作用。FOXO1A是FOX家族中FOXO亞家族的成員之一，其上游受PI3K/Akt磷酸化級聯(lián)通路的調(diào)節(jié)?；罨腁kt能使FOXO1A的Thr24、Ser256和 Ser319發(fā)生磷酸化修飾，促使FOXO1A核排除，即由細(xì)胞核進(jìn)入胞質(zhì)中，進(jìn)而失去轉(zhuǎn)錄活性［13］。在本研究中，CRM197作用后能夠抑制hCMEC/D3細(xì)胞中Akt的磷酸化水平，減弱p-FOXO1A(Ser256)的活性，增加FOXO1A在細(xì)胞核中的分布，進(jìn)而可能參與caveolin-1表達(dá)的上調(diào)。由于質(zhì)膜微囊caveolin-1能夠通過影響血腫瘤屏障的跨細(xì)胞途徑參與屏障通透性的調(diào)節(jié)，上調(diào)的caveolin-1可能通過促進(jìn)血腫瘤屏障內(nèi)皮細(xì)胞中吞飲小泡的形成，增加CRM197-HRP通過血腫瘤屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)水平。

綜上所述，CRM197能有效轉(zhuǎn)運(yùn)HRP通過血腫瘤屏障，其作用機(jī)制可能與CRM197抑制血腫瘤屏障內(nèi)皮細(xì)胞中PI3K/Akt信號通路，減少FOXO1A的磷酸化水平，進(jìn)而增加caveolin-1的表達(dá)有關(guān)。CRM197有希望轉(zhuǎn)運(yùn)大分子藥物通過血腫瘤屏障，治療腦腫瘤，其作用效果及機(jī)制仍需深入研究。

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