脊髓損傷動物模型的運動功能評價

顧 兵，金建波，李華南，張國福

(1.江西科技師范學院藥學院，江西 南昌 330013;2.江西中醫(yī)學院藥學院，江西 南昌 330006)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是由于椎體的移位或碎骨片突出于椎管內(nèi)造成脊髓或馬尾神經(jīng)不同程度的損傷，出現(xiàn)與損傷節(jié)段相應(yīng)的各種運動、感覺和括約肌功能障礙、肌張力異常以及病理反射等改變。國內(nèi)外已經(jīng)建立了脊髓挫傷、壓迫損傷、橫斷損傷、缺血損傷、牽張損傷和化學損傷等多種SCI動物模型，并且開展了部分神經(jīng)保護藥物的藥效學篩選［1］。但在實際研究中發(fā)現(xiàn)，動物模型與臨床SCI仍有很大區(qū)別，需要建立一套完整的、客觀的運動功能評價系統(tǒng)，這對進一步探討SCI發(fā)生發(fā)展機制和損傷后的修復(fù)治療顯得尤為重要［2］?，F(xiàn)有的SCI動物模型的運動功能評價方法可大致分為開放場地試驗(open field test)，非開放性場地試驗(non-open field test)和聯(lián)合行為學評分法(combined behavioral score)3類，具體分類如Fig 1所示。本文就各種SCI動物模型的運動功能評價方法及其優(yōu)缺點作系統(tǒng)綜述，方便研究者根據(jù)實驗治療學的需要選用合適的模型及其評價方法。

1 Tarlov法(Tarlov test)

1953年Tarlov等首次描述開放場地試驗，并應(yīng)用于動物脊髓壓迫損傷后的運動功能評價，內(nèi)容有關(guān)節(jié)活動度，能否行走、跑步等。其特點是對靈長類動物較為可靠，且與脊髓損傷程度、神經(jīng)功能恢復(fù)及軸突殘存數(shù)量等的相關(guān)性較好，但對嚙齒類動物一致性較差［3］。由于觀察者存在主觀隨意性，在不同實驗環(huán)境下重復(fù)性不高。隨后許多學者對Tarlov法進行了諸多改良，并將此法應(yīng)用于大鼠后肢功能評價。Kazanci等［4］采用Tarlov法評價家兔脊髓缺血損傷后的運動功能，表明美西律具有明顯改善神經(jīng)功能和緩解組織病理損傷的作用，但與甲潑尼龍(強大的抗氧化劑)比較無統(tǒng)計學差異。Liang等［5］探討川芎嗪和去鐵胺治療大鼠脊髓缺血損傷的聯(lián)合效應(yīng)，結(jié)果治療組Tarlov評分明顯高于對照組，且截癱發(fā)生率與形態(tài)學改變存在相關(guān)性。改良的Tarlov法雖然較為簡單，但評分跨度大，容易呈跳躍性分布，較難判別嚙齒類動物SCI程度上的差異，也難以揭示神經(jīng)功能恢復(fù)的整個過程。因此，Tarlov法僅作為嚙齒類動物SCI程度的初步篩選，適合與其他行為學方法結(jié)合使用。Akdemir等［6］采用改良后的Tarlov法分級標準和斜板試驗，評價經(jīng)SJA6017(一種鈣蛋白酶抑制劑)治療后的SCI大鼠后肢功能的改善狀況，提示抑制鈣蛋白酶誘導的細胞凋亡可能是一種可行的SCI治療策略。

2 BBB法(Basso-Beattie-Bresnahan test)

1995年Basso等以Tarlov法的開放場地試驗為基礎(chǔ)提出一種新的神經(jīng)運動功能評價方法(簡稱BBB法)。該法分級較細致，幾乎包括了SCI后大鼠后肢恢復(fù)過程中所有行為學變化，且與脊髓損傷的程度高度相符。該法是目前許多研究者較為推崇的一種方法。主要是將動物置于環(huán)形封閉金屬殼內(nèi)，兩個觀察者對側(cè)站立觀察后肢運動功能變化，觀察期為5 min，期間觀察者依照評分標準進行評分。根據(jù)評分結(jié)果，可以把SCI分為癱瘓、早期恢復(fù)、中期恢復(fù)和最后恢復(fù)4個階段。Basso等認為該法專門用于評價大鼠SCI后后肢運動功能恢復(fù)情況，尤其是低位胸段脊髓挫傷后運動功能評價。其次，評分結(jié)果具有靈活性，可用于探討運動功能恢復(fù)機制。由于記分呈漸進性排列，能夠反映早期、中期及晚期的行為變化，揭示SCI恢復(fù)的全過程。Lankhorst等在此基礎(chǔ)上又增加了數(shù)據(jù)的輸入、儲存和分析，方便了數(shù)據(jù)間相互比較。Li等［7］改良了BBB法，并應(yīng)用于小鼠SCI模型的運動功能評價。與斜板試驗相比較更具敏感性，本法變異系數(shù)更小。Pinzon等［8］報道米諾環(huán)素治療并未引起SCI大鼠行為學或組織病理學的改變，呼吁臨床脊髓挫傷之后使用米諾環(huán)素治療尚需要作進一步細致的研究。Takeda等［9］報道利用米諾環(huán)素治療大鼠脊髓缺血損傷，而后借助BBB法評判大鼠后肢運動功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療組動物BBB評分和正常神經(jīng)元數(shù)量明顯高于對照組。BBB法用于評價前后肢運動功能時，需要采用雙盲、雙人獨立觀察記錄，這樣評分結(jié)果更具有客觀性。因評分細節(jié)較多，對于初學者不易掌握。BBB法僅適用于輕、中度損傷，而對重型損傷的評判敏感性不高。

Fig 1 Schematic classification of motor function evaluation methods of animal models for spinal cord injury

3 步態(tài)分析(gait analysis)

de Medinaceli等最早于1982年建立了腳印分析(footprint analysis)方法，并將其應(yīng)用于大鼠神經(jīng)運動功能評估，后經(jīng)Metz等［10］進行諸多改良。該法是將試驗動物爪子涂以不同顏色的墨汁，并讓其在木桿上行走，以跨步距離、爪子負重以及爪子活動角度為指標進行分析。但由于動物跨步距離和爪子活動角度難以精確測量，可靠性較差。Jia等［11］報道傳統(tǒng)中藥疏血通能明顯促進脊髓血液循環(huán)，減少繼發(fā)性損傷，保護缺血區(qū)神經(jīng)元。采用Tarlov評分法和腳印分析法證實疏血通能促進損傷脊髓的運動功能恢復(fù)。CatWalk分析系統(tǒng)是繼BBB法之后，學術(shù)界廣為推崇的一種研究動物步態(tài)的自動評價體系。一般重大的原創(chuàng)性的實驗治療學結(jié)果，建議采用CatWalk步態(tài)分析法證實。該法能夠提供大量不同運動功能的分析數(shù)據(jù)，包括著地時間、懸空時間、步長、左右腳間距、步序等［12］。與BBB法相比，CatWalk步態(tài)分析法克服了因動物快速運動而難以作出準確評估的缺陷，適合前后肢協(xié)調(diào)性評價［13］。其次，該法也大大減少了人為因素的影響，使得評價結(jié)果的可靠性大大提高。Salazar等［14］采用Catwalk步態(tài)分析和BBB法觀察小鼠脊髓挫傷后30 d，移植人類神經(jīng)干細胞的治療效果。結(jié)果顯示小鼠運動功能在移植后d 2就得到明顯改善。

跑臺試驗(treadmill test)是在Catwalk裝置的基礎(chǔ)上進行的又一次改進。主要是把透明跑道轉(zhuǎn)換成一條可運轉(zhuǎn)的跑步帶，以便更有利于步態(tài)分析。據(jù)國外的文獻報道有Digit步態(tài)系統(tǒng)和Treadscan步態(tài)系統(tǒng)兩種。該試驗可用于動物肢體協(xié)調(diào)性及水平或傾斜步態(tài)力學分析，適合對小型嚙齒類動物的研究。其次，步態(tài)參數(shù)與跑步帶的速率呈相關(guān)性，便于進行不同階段神經(jīng)運動功能的評估。此法不再需要對試驗動物前后肢涂墨汁，彌補了腳印分析的缺陷。因此，跑臺試驗被廣泛應(yīng)用于大腦感覺運動皮質(zhì)損傷和SCI后的神經(jīng)再生研究，其不足是需要購置昂貴的帶高速攝像機的跑步機以及配套的數(shù)據(jù)采集分析軟件。Li等［15］報道激活Nogo-66受體可以促進成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的軸突生長，跑臺試驗、改良BBB法、斜板試驗和傾斜網(wǎng)格爬行評分均明顯提高。

4 網(wǎng)格爬行(grid walking)

爬網(wǎng)格試驗是檢測動物腦或脊髓損傷后是否精確控制后爪放置能力的一種評價方法，適用于貓、鼠等小型動物。根據(jù)網(wǎng)格放置角度不同，可分為水平網(wǎng)格試驗和傾斜網(wǎng)格試驗［16］。該方法是將試驗動物置于水平或傾斜的網(wǎng)格上(兩桿之間距離2.5 cm)，以訓練動物在網(wǎng)格上方尋找食物與水，記錄在此過程中大鼠后爪失足落空次數(shù)，發(fā)出腳步聲次數(shù)以及通過這段距離的時間等行為學數(shù)據(jù)。缺點是網(wǎng)格線太細，對后肢失足不易評價。要求訓練者把握評價的每個細節(jié)，以便準確判別損傷與非損傷行為學變化。人為因素影響較大，耗時耗力，并且費用高。動物行走速度過快時不易觀察。之后，Prakriya等建立了一套網(wǎng)格爬行試驗自動分析系統(tǒng)，首先用于評價T12-T13脊髓背側(cè)橫斷損傷后的行為學改變。對于行為學判斷更為精確化，尤其是判別腳步聲的持續(xù)性。具有操作簡便，耗時短，可比性高等優(yōu)點。但是，細小的行為變化，如輕微失足，仍較難檢測。此外，由于一維感覺模式的局限，難以區(qū)分左右后肢的腳步聲。Xu等［17］聯(lián)合應(yīng)用神經(jīng)干細胞移植和NgR免疫接種來改善成年大鼠SCI后的運動功能，網(wǎng)格爬行試驗的指標和BBB評分明顯好于單個藥物的治療效果。

5 平衡木行走(beam walking)

平衡木行走可分為階梯平衡木(ladder beam test)和狹窄平衡木(narrow beam test)兩種試驗。前者用來評價動物控制前后爪的放置能力，方法是將動物置于階梯平衡杠桿上，記錄前后肢滑落杠桿的次數(shù)，由DV視頻采集數(shù)據(jù)。Cummings等［18］制作了改良的階梯平衡木裝置及其評分系統(tǒng)，并用于評價T9脊髓挫傷小鼠的后肢功能。最為關(guān)鍵的是，水平階梯平衡木行走試驗?zāi)鼙鎰e在開放場地試驗中腳步頻率相等的小鼠。該法的特點是受試對象訓練時間短，參數(shù)評估準確，試驗過程便于重復(fù)觀察。其次，有利于辨別小鼠BBB評分中第5～7點和大鼠BBB評分中第9～13點的行為變化。但與BBB法不同的是，該法主要評價感覺運動皮層損傷或SCI，尤其是高位頸部SCI引起的前后肢功能障礙［19］。另外，該法可對某些區(qū)域功能恢復(fù)能力加以辨別，如負重行走。Fiore等［20］將階梯裝置傾斜至40°建立傾斜階梯平衡木試驗分析小鼠失足指標。小鼠中等程度的脊髓挫傷采用神經(jīng)甾體脫氫表雄酮治療后，運動行為障礙減輕，而且行為學結(jié)果與神經(jīng)病理學改變呈一定相關(guān)性。1975年Hicks等建立狹長平衡木裝置評價大鼠SCI后身體平衡能力，失足次數(shù)等指標，適用于SCI模型及顱腦感覺運動皮層損傷的行為學評估。根據(jù)試驗要求，通常將平衡木分為3種規(guī)格:1.2 cm、2.3 cm矩形平衡木和2.5 cm直徑的圓柱形平衡木。Kunkel-Bagden等認為狹窄平衡木試驗可定量評估SCI大鼠的運動功能。郭麗萍等采用改良的狹窄平衡木試驗評價大鼠顱腦損傷后的協(xié)調(diào)肌肉運動以及保持平衡的能力，并將損傷程度量化測試。缺點是平衡木越狹窄，試驗動物的失足次數(shù)越多，導致評估結(jié)果可靠性降低。Merkler等［21］報道在采用Nogo-A(一種髓鞘相關(guān)軸突生長抑制劑)抗體中和抑制性抗原的抑制作用研究中，狹窄平衡木試驗、BBB評分及爬網(wǎng)格試驗評分結(jié)果都有明顯提高。

6 胸腰高度試驗(thoracolumbar height test)

胸腰高度試驗是通過監(jiān)控設(shè)備觀察大鼠通過透明跑道走廊時胸腰椎高度，借此分析大鼠后肢是部分負重還是全部負重。van de Meent等［22］將SCI后大鼠分別置于3個不同類型的環(huán)境中，分別采用胸腰高度試驗、BBB評分和Catwalk步態(tài)分析、網(wǎng)格試驗評價其行為學改變。結(jié)果表明SCI大鼠在富裕環(huán)境中進行訓練達到一定閾值，運動功能會得到明顯改善，但運動功能恢復(fù)不會再隨強度增加而增加。缺點是不適用于輕型或極重型SCI模型的行為學評估，只能作為行為學評價的一種輔助手段。

7 斜板試驗(inclined plane test)

斜板試驗裝置主要由2個直角夾板構(gòu)成，通過鉸鏈將夾板相互連接。斜板側(cè)面設(shè)有角度板，便于調(diào)整角度。方法是將實驗動物置于一斜板上，通過調(diào)整斜板角度獲取動物SCI后在斜板上維持5 s的最大角度值。斜板試驗的設(shè)備制作簡單，方法簡便，重復(fù)性好，無創(chuàng)傷性，且與SCI程度相關(guān)性高，比較適用于輕中度SCI模型。1998年Yonemori等將斜板試驗進行了技術(shù)上的改造。具體是將大鼠置于水平斜板上(0°)，然后逐漸升至30°作為起始角度，隨后以2度/秒的速度增大，直到動物從斜板上滑落，記錄最大角度值。Han等［23］報道實驗性SCI大鼠給予降血脂藥物辛伐他丁后，斜板試驗角度以及BBB評分均明顯提高，認為這種神經(jīng)保護功效可能與上調(diào)BDNF和GDNF的表達有關(guān)。國內(nèi)學者通過斜板試驗與Tarlov法相結(jié)合的方法，觀察中藥龜板對大鼠SCI后后肢功能恢復(fù)情況。為使該法更具可靠性，通常把整個實驗過程分為預(yù)實驗和正式實驗兩個階段。預(yù)實驗的目的是使試驗動物適應(yīng)環(huán)境，避免在正式實驗中出現(xiàn)恐懼神態(tài)而影響評估結(jié)果。斜板試驗缺點是難以揭示大鼠神經(jīng)功能的細微改變，如爪的位置，尾的下垂或上翹，從而影響運動功能的整體評價。宋煥瑾等通過對銀杏葉提取物治療大鼠SCI后下肢運動功能恢復(fù)程度進行觀察，結(jié)果斜板試驗和BBB法檢測值與脊髓損傷程度有明顯相關(guān)性。認為多種行為學相結(jié)合的評價方式可彌補了單一評定方法的不足，有效地提高了評分的準確性及敏感性。

8 肢體肌力試驗(limb muscle strength test)

肢體肌力試驗根據(jù)實驗裝置的不同，可分為肢體懸掛試驗(limb hanging test)和肢體握力試驗(limb grip strength test)。前者可用于前后肢功能的評價，尤其是頸段SCI后前肢肌肉功能評估。Diener等建立的肢體懸掛試驗，其裝置由15 cm長，2 mm直徑的木棒構(gòu)成。試驗時將動物前爪輕放于一懸掛木棒上，通過檢測動物緊握木棒的能力及時間來評價肢體肌力。與Tarlov法相比較，對于中度至輕重度損傷的動物模型，其評價結(jié)果準確性更高。缺點是對輕度或極重度損傷敏感性低，須與其他行為學方法結(jié)合使用。肢體握力試驗的方法是通過試驗動物緊握連有握力表的套圈，以握力表中讀數(shù)衡量動物運動肌力恢復(fù)情況。Anderson等［24］指出肢體握力試驗具有方便，可定量分析的特點，適用于頸段SCI模型的前肢運動功能評價，但不適用于重度損傷模型。Aguilar等［25］采用改良的肢體握力試驗評價小鼠C5雙側(cè)SCI后前肢的運動功能。

9 聯(lián)合評分法(combined behavioral score)

Gale等［26］在Tarlov法與斜板法相結(jié)合的基礎(chǔ)上增加感覺、反射等一些指標建立了聯(lián)合評分法(CBS)，內(nèi)容包括后肢運動、斜板試驗、伸趾、回縮反應(yīng)、熱板試驗和游泳等7項。各項數(shù)值代表SCI后神經(jīng)功能喪失的百分比。CBS法能較為準確地綜合評定SCI大鼠運動、感覺等多方面神經(jīng)功能。缺點是所需設(shè)備較復(fù)雜、人為因素較多而不利于推廣。此后Kerasidis等對CBS評分標準進行修正，刪減了其中的“正常行走:0分”選項，將“后肢能負重，會步行1次或2次”改為“后肢能負重，會步行數(shù)次”，從而減少人為因素，提高了評分的可靠性。von Euler等在不同程度的脊髓壓迫損傷模型上證實，采用CBS法和BBB法評價的運動功能結(jié)果與組織形態(tài)學改變有很好的相關(guān)性。Hara等［27］報道鹽酸法舒地爾(異喹啉磺胺衍生物)治療大鼠T3脊髓壓迫損傷的療效。研究中采用改良的CBS評價SCI動物的運動功能，結(jié)果藥物組的行為學指標明顯好于甲強龍對照組。國內(nèi)學者研究了手術(shù)減壓對大鼠慢性SCI的作用及相關(guān)機制，CBS結(jié)果表明手術(shù)減壓治療可促進脊髓運動神經(jīng)元合成乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶，改善動物運動功能。

臨床SCI往往是多種類型的損傷相互并存，單純某一類型的損傷并不多見。不同的脊髓損傷動物模型復(fù)制出不同類型的解剖結(jié)構(gòu)損傷以及相應(yīng)的行為學改變，以至于任何一種動物模型都不可能完全模擬臨床SCI的特征。目前臨床SCI神經(jīng)運動功能的評價仍然沿用美國脊髓損傷學會/國際脊髓學會分級標準。內(nèi)容包括神經(jīng)系統(tǒng)檢查的評價、輔助檢查的評價(指影像學和電生理學檢查)和日常生活能力的評價3個部分。神經(jīng)系統(tǒng)檢查的必檢部分有神經(jīng)損傷水平、感覺平面、運動平面、損傷程度評分、骶部殘存、部分保留區(qū)、完全或不完全損傷和四肢癱或截癱。但是，這套分級標準仍存在局限性，如功能獨立性評定不能完全反映損傷患者的恢復(fù)情況等。Chafetz等［28］報道如何提高運動感覺評分的精確性，指出不論醫(yī)生在SCI領(lǐng)域的經(jīng)驗如何，接受正式的標準化培訓是至關(guān)重要的。因此，理想的動物模型運動功能評價方法必須緊密結(jié)合臨床實際SCI評價標準，首先受試對象個體影響小，能較好地對不同階段的神經(jīng)行為學改變作出準確判斷;其次要求評價裝置成本低廉，使用簡便，實驗耗時短。

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