高效液相色譜法測定飼料添加劑中鹽酸林可霉素的含量

程建國 宋艷紅 王仲琴 徐 景 趙晶晶

鹽酸林可霉素又稱鹽酸潔霉素，主要用于治療革蘭氏陽性菌和支原體感染。對葡萄球菌、溶血性鏈球菌作用較強(qiáng)，對厭氧菌如破傷風(fēng)梭菌、產(chǎn)氣莢膜芽孢桿菌有抑制作用，對豬痢疾密螺旋體和弓形蟲也有一定作用。用作飼料添加劑時(shí)，可促進(jìn)肉雞和育肥豬的生長，提高飼料利用率。因此，鹽酸林可霉素常被加在育肥豬和肉雞飼料添加劑中，為了更好地控制飼料添加劑的質(zhì)量，我們對高效液相色譜法測定飼料中鹽酸林可霉素含量的方法進(jìn)行了研究。

1 儀器與試藥

WATERS2695高效液相色譜儀（包括四元泵，DAD 檢測器，柱溫箱，10 μl自動進(jìn)樣器）；KQ－100超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)）；Thermo sorvall型離心機(jī)；Sartorius BP210S型電子天平。

鹽酸林可霉素對照品 (中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所生產(chǎn)，批號：K0101003，含量 84.9%)，甲醇為色譜純，其它試劑為分析純。供試品為育肥豬飼料添加劑，添加量為5%。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取鹽酸林可霉素對照品0.05892 g(含鹽酸林可霉素0.05002 g)，置100 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成每1 ml中含0.5002 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

稱取供試品5.0 g 7份，分別置25 ml離心管中，精密稱取對照品，①0.26 mg、②2.61 mg、③4.72 mg、④6.25 mg、⑤7.76 mg、⑥8.69 mg、⑦0 mg 分別添加入①～⑦號供試品中，編號一一對應(yīng)，其中⑦號供試品作為空白樣品，取上述供試品，分別精密加入甲醇15 ml，使供試品濕潤，輕輕搖勻，超聲20 min，5000轉(zhuǎn)離心5 min，取上清液用0.45 μm濾膜過濾后，作為供試品溶液。

2.3 色譜條件

Inertsil ODS－3 色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相[1]：0.05 mol/l硼砂溶液： 甲醇（55： 45）；流速：1.0 ml/min；檢測波長[2]：214 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量10 μl，出峰時(shí)間快，峰形比較好，按上述條件檢測對照品溶液結(jié)果如圖1，空白樣品結(jié)果如圖2，供試品溶液結(jié)果如圖3。

圖1 對照品結(jié)果

圖2 空白樣品結(jié)果

圖3 供試品結(jié)果

2.3.1 色譜柱的理論塔板數(shù)

在2.3的條件下，注入對照品溶液，鹽酸林可霉素保留時(shí)間為9.2min，林可霉素B峰保留時(shí)間為4.7min，鹽酸林可霉素峰半峰高寬（Wh/2）為0.42 min，計(jì)算色譜柱的理論板數(shù)為2658。鹽酸林可霉素和林可霉素B，兩峰之間的分離度為5。

2.3.2 拖尾因子

將2.1項(xiàng)配制的對照品溶液按2.3條件測得林可霉素峰W0.05h為1.08 min，峰極大至峰前沿的距離d1為0.53 min，拖尾因子T為1.02，同樣測得林可霉素B峰 W0.05h為 0.52 min，d1為 0.25 min，T 為 1.04，二者拖尾因子均在0.95～1.05。

2.4 線性關(guān)系考察

將對照品添加制成的①～⑥號溶液，按2.2色譜條件測定，結(jié)果見表1。以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，對照品質(zhì)量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：y=1×106x+2030.6，R2=0.9987，表明林可霉素在 14.7～492 μg/ml范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。

表1 線性范圍考察結(jié)果

2.5 靈敏度

用2.2項(xiàng)配制的供試品溶液，按信噪比為3時(shí)測得鹽酸林可霉素的檢測限為0.15 μg，當(dāng)信噪比為10時(shí)測得鹽酸林可霉素的定量限為0.49 μg。

2.6 精密度

取2.2供試品④號（0.354 mg/ml）溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，峰面積結(jié)果分別為 492017、493356、492786、492394、494011，平均 680980,RSD=0.16%（n=5）。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取2.1對照品溶液(0.5002 mg/ml)和2.2供試品④號溶液（0.354 mg/ml）按2.3條件進(jìn)樣檢測，每隔一定時(shí)間進(jìn)樣一次，結(jié)果見表2。表明在5 h內(nèi)，對照品和供試品溶液穩(wěn)定性良好。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.8 回收率試驗(yàn)

采用加樣回收法，鹽酸林可霉素在育肥豬飼料中的添加量為每千克飼料添加40～70 mg，試驗(yàn)所用供試品為5%添加的育肥豬飼料添加劑，這樣鹽酸林可霉素在添加劑中的含量為0.8～1.4 mg/g，試驗(yàn)中選取了0.8、1.1、1.4 mg/g三個(gè)添加濃度來測定回收率，每個(gè)濃度添加3份，結(jié)果見表3。

3 討論

表3 回收率試驗(yàn)

對供試品的超聲提取時(shí)間進(jìn)行了考察，分別設(shè)定10、15、20、25、30 min，從檢測結(jié)果來看，提取 20 min，檢測結(jié)果穩(wěn)定，回收率均在97%～100%，因此定為20 min。

4 結(jié)論

本研究所采用的檢測方法，靈敏、可靠、檢測結(jié)果穩(wěn)定，可用于飼料添加劑中鹽酸林可霉素含量的檢測。

[1]陳明,耿志明,王冉,等.高效液相色譜法測定飼料中林可霉素的含量[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2008,24(1):99-100.

[2]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部《中國獸藥典》2005版第一冊.