大慶鹽堿土中微生物的分離及芽孢桿菌的鑒定

張飛鵬，林志偉，張振南，靳學(xué)慧

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，大慶 163319）

土壤是微生物生存的良好環(huán)境，土壤中有多種類群的微生物，它們對(duì)自然界物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和循環(huán)起著極為重要的作用，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境保護(hù)有著不可忽視的影響[1]。微生物的分離純化是研究土壤微生物的主要方法之一，對(duì)土壤中微生物群體結(jié)構(gòu)分析能反映出土壤生物活性和土壤肥力狀況[2]。在鹽堿土中，因可溶性鹽類含量高而提高了土壤交換物質(zhì)的飽和度，從而對(duì)作物產(chǎn)生有害影響[3]。大慶地區(qū)鹽漬化土壤屬于蘇達(dá)鹽堿化土壤，其特點(diǎn)是pH值在8以上，NaHCO3含量也很高，毒性大，抑制了該區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展[4]。芽孢桿菌屬（Bacillus）細(xì)菌對(duì)高溫、紫外線、干燥、電離輻射和很多有毒的化學(xué)物質(zhì)都有很強(qiáng)的抗性，能在極端條件下生存[5]，可用于土壤修復(fù)、防治植物病害、降解土壤中難溶的含磷、含鉀化合物等，有著十分廣泛的應(yīng)用價(jià)值[6]。以大慶鹽堿土壤為材料，分離統(tǒng)計(jì)土壤中各類微生物菌落，初步了解本地區(qū)土壤微生物的構(gòu)成情況，為有效利用本地適生有益微生物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)土壤

供試土壤取自黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)校區(qū)外周草地的鹽堿土。分別在4個(gè)方向選取3點(diǎn)，每點(diǎn)按1 m×1 m取樣，每點(diǎn)取土深度15 cm，將樣點(diǎn)土壤混均后取200 g裝入無菌三角瓶中，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 供試培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，高氏1號(hào)培養(yǎng)基，馬丁氏培養(yǎng)基，糖發(fā)酵試驗(yàn)培養(yǎng)基，V.P.培養(yǎng)基，明膠液化培養(yǎng)基，淀粉水解培養(yǎng)基，苯丙氨酸培養(yǎng)基，硝酸鹽液體培養(yǎng)基，產(chǎn)吲哚培養(yǎng)基，檸檬酸鹽培養(yǎng)基。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 土壤微生物的分離與計(jì)數(shù)

利用平板稀釋法分離土樣中細(xì)菌、放線菌和霉菌[7]。將 1 g 土樣用無菌水配制 10-3、10-4、10-5稀釋度的懸濁液，分別在無菌條件下涂布于牛肉膏蛋白胨、高氏1號(hào)和馬丁培養(yǎng)基制成的平板上，然后置于適宜溫度下培養(yǎng)。在30～37℃條件下培養(yǎng)1～2 d后對(duì)細(xì)菌菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)；在28℃條件下培養(yǎng)5～7 d后對(duì)放線菌菌落計(jì)數(shù)；在28～30℃條件下培養(yǎng)3～5 d后對(duì)霉菌菌落計(jì)數(shù)。每項(xiàng)試驗(yàn)重復(fù)3次。

芽孢桿菌的分離純化是分別取20mL上述各濃度土壤懸液，經(jīng)80℃熱處理30min后，無菌條件下涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基制成的平板上，在30℃條件下培養(yǎng)1～2 d后對(duì)芽孢桿菌菌落計(jì)數(shù)。每項(xiàng)試驗(yàn)重復(fù)3次。并將上述分離得到的芽孢桿菌菌落通過平板劃線稀釋法進(jìn)行純化，獲得相應(yīng)菌落的純化菌株。

總菌落數(shù)計(jì)算方法是選擇長(zhǎng)出菌落數(shù)30～300之間的培養(yǎng)皿進(jìn)行計(jì)數(shù)，按以下公式計(jì)算總菌數(shù)。總菌數(shù)（cfu/g）=同一稀釋度幾次重復(fù)的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)[8]。

1.3.2 微生物類群的劃分

依據(jù)微生物的形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和生態(tài)學(xué)特征對(duì)所獲得的菌落進(jìn)行逐個(gè)觀察與識(shí)別，初步劃分為細(xì)菌、放線菌和霉菌三大類群。

1.3.3 芽孢桿菌的鑒定

依據(jù)菌落形態(tài)特征、個(gè)體形態(tài)特征和生理生化反應(yīng)進(jìn)行鑒定。菌落形態(tài)特征主要觀察菌落的形狀、邊緣情況、粘稠度、隆起情況、質(zhì)地及顏色等。個(gè)體形態(tài)特征主要在高倍鏡及油鏡下觀察單一菌株芽孢的直徑、形狀、著生位置及與菌體大小的比較。生理生化指標(biāo)測(cè)定主要是對(duì)純化的芽孢桿菌進(jìn)行糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)（葡萄糖、阿拉伯糖）、接觸酶反應(yīng)實(shí)驗(yàn)、伏普實(shí)驗(yàn)（V.P.）、明膠反應(yīng)實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、苯丙氨酸脫氧實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn)[2，9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 各類群微生物的分離比例

大慶鹽堿土中有大量微生物生存。分離的結(jié)果表明，1 g堿性土壤中細(xì)菌菌落數(shù)為8.4×105cfu·g-1，占總菌落的59.45%，其中芽孢桿菌菌落數(shù)為6.2×105cfu·g-1，占總菌落的 43.88%；放線菌菌落數(shù)為 5.5×105cfu·g-1，占總菌落的 38.92%；霉菌菌落數(shù)為 2.3×104cfu·g-1，占總菌落的 1.63%。

2.2 芽孢桿菌的分類鑒定

2.2.1 菌落形態(tài)特征的觀察結(jié)果

通過對(duì)平板稀釋分離中所得芽孢桿菌菌株的純化，共得到7個(gè)表現(xiàn)不同的芽孢桿菌菌落，編號(hào)為1～7號(hào)菌株。其菌落形狀、邊緣情況、粘稠度、隆起情況、質(zhì)地及顏色見表1。

表1 1～7號(hào)芽孢桿菌菌株的菌落形態(tài)特征Table 1 Shape of Bacillus clone from 1 to 7

2.2.2 菌株個(gè)體形態(tài)的觀察結(jié)果

取以上編號(hào)的1～7號(hào)菌株，在油鏡下觀察各菌株的芽孢的直徑、形狀、著生位置及與菌體大小的比較，結(jié)果見表2。

2.2.3 生理生化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果

將7株純化后的芽孢桿菌進(jìn)行糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)（葡萄糖、阿拉伯糖）、接觸酶反應(yīng)實(shí)驗(yàn)、伏普實(shí)驗(yàn)（V.P.）、明膠反應(yīng)實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、苯丙氨酸脫氧實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)和檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn)，獲得7株芽孢桿菌的部分生理生化特征，結(jié)果見表3。

表2 各芽孢桿菌菌株的芽孢形態(tài)特征Table 2 Shape of Bacillus spore

表3 各芽孢桿菌菌株的部分生理生化指標(biāo)Table 3 The physio-biochemistry characteristics of different Bacillus sp.

2.2.4 芽孢桿菌的鑒定結(jié)果

由表2，3，4的結(jié)果可初步鑒定1～7號(hào)菌株依次分別為嗜堿芽孢桿菌（Bacllus alcalophilus），枯草芽孢桿菌（B.subtilis），側(cè)微芽孢桿菌（B.laterosporu），短芽孢桿菌（B.brevi），地衣芽孢桿菌（B.lichenif ormis），環(huán)狀芽孢桿菌（B.circulans），圓孢芽孢桿菌（B.globisporus.）。在分離得到的芽孢桿菌菌落中，B.brevi出現(xiàn)頻率最高，為優(yōu)勢(shì)菌株。

3 分析與討論

在所取得的土樣中，分離到了不同的微生物類群，其中細(xì)菌與放線菌的比例稍高，而霉菌數(shù)量偏低，這可能與大慶鹽堿土pH值較高有關(guān)，因?yàn)槊咕L(zhǎng)的最適宜pH值為5.0～6.5。在鹽堿土壤環(huán)境中，除了pH較高不適宜霉菌生長(zhǎng)外，土壤中的有機(jī)質(zhì)含量也較低，故分離到的霉菌多數(shù)為腐生能力較強(qiáng)的根霉與木霉；放線菌由于比較適合干旱和偏高的pH范圍，相對(duì)來說數(shù)量較大。細(xì)菌中芽孢桿菌在分離到的細(xì)菌中占的比例較高，可達(dá)到65%左右，占分離到的微生物數(shù)量的40%左右，僅次于放線菌。

參考廖延雄，傅筱沖[10]的雙歧氏分類檢索系統(tǒng)，對(duì)分離到的7種不同菌落形態(tài)的芽孢桿菌進(jìn)行生理生化指標(biāo)檢測(cè)，初步試驗(yàn)結(jié)果表明，被檢測(cè)的7種菌落分別歸屬于7種不同的芽孢桿菌，具體的分類地位歸屬還有待進(jìn)一步研究。在分離到的芽孢桿菌菌落中，4號(hào)菌株（B.brevi）菌落特征出現(xiàn)的比例較高，可以初步認(rèn)為B.brevi為芽孢桿菌中的優(yōu)勢(shì)種。

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