日本血吸蟲基因重組抗原rSj06868對(duì)小鼠的免疫保護(hù)效果

王素娟，劉金明，邢榮鶴，石耀軍，金亞美，李 浩，林矯矯

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 國(guó)家防治動(dòng)物血吸蟲病專業(yè)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 200241）

日本血吸蟲病是典型的人畜共患病，迄今仍是我國(guó)重要的公共衛(wèi)生問題之一?；疾〖倚筇貏e是病牛是我國(guó)血吸蟲病的主要傳染源[1,2]。我國(guó)從20世紀(jì)50年代開始大規(guī)模的血吸蟲病防治，先后實(shí)施了以滅螺為主的綜合防治對(duì)策、以化療為主結(jié)合易感地帶滅螺和以控制傳染源為主的綜合防治策略[3]?，F(xiàn)在，廣東、上海、福建、廣西、浙江等5個(gè)?。ㄊ袇^(qū)）已阻斷了血吸蟲病傳播，四川省、云南省達(dá)到了血吸蟲病傳播控制目標(biāo)。但由于影響血吸蟲病流行的社會(huì)、自然因素未得到根本改變，特別是社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，以前一些行之有效的措施如大規(guī)模的化學(xué)藥物滅螺難以繼續(xù)實(shí)施，加之家畜血吸蟲病重復(fù)感染嚴(yán)重，單靠藥物治療難以根除血吸蟲病，因此研制家畜抗日本血吸蟲疫苗是控制血吸蟲病的重要策略。目前雖然已篩選到一些有潛力的候選疫苗分子，但它們所產(chǎn)生的抗日本血吸蟲抗性不能達(dá)到現(xiàn)場(chǎng)防治的要求[3]，仍然需要繼續(xù)尋找有效的候選疫苗分子。本課題組在前期工作中利用東方田鼠血清、肝臟和肺臟裂解物篩選44 d日本血吸蟲噬菌體展示cDNA文庫(kù)，獲得多個(gè)可能與東方田鼠抗性相關(guān)靶基因陽(yáng)性噬菌體克隆[5-7]，并對(duì)獲得的部分陽(yáng)性噬菌體克隆的免疫效果進(jìn)行了觀察[8,9]，發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲假想蛋白SJCHGC068068的噬菌體展示抗原誘導(dǎo)了24.28%的減蟲率以及45.52%肝臟蟲卵減少率。為進(jìn)一步探索該蛋白作為抗血吸蟲候選疫苗分子的可能性，本文對(duì)其編碼基因（暫命名為Sj06868）進(jìn)行克隆、表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的免疫效果進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)觀察。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、質(zhì)粒及菌株 感染日本血吸蟲中國(guó)大陸株安徽品系的陽(yáng)性釘螺購(gòu)自于江蘇省血吸蟲防治研究所，以光照法孵出尾蚴；6～7周齡周齡SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；新西蘭白兔( 雄性， 2.5～3.0 kg )購(gòu)自上海羅涇飛達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)；質(zhì)粒pET32a、大腸桿菌Rosetta（DE3）由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要試劑 His Bind Kit購(gòu)自Novagen公司；TRIzol Reagent為上海英駿生物公司產(chǎn)品；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)、DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000/DL15000購(gòu)自寶生生物工程（大連）有限公司；預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)PageR μlerTMPrestained Prorein Ladder為Fermentas產(chǎn)品；HRP-山羊抗鼠購(gòu)自Sigma公司; 206佐劑由法國(guó)賽比克公司饋贈(zèng)；DNA純化試劑盒（Gel/Gel PCR DNA Fragments Extraction Kit） 為Geneaid Biotech公 司 產(chǎn) 品；Plasmid Minipreps Purification Systems質(zhì)粒DNA小量快速提取試劑盒為BioDev產(chǎn)品，購(gòu)自德普生物科技（北京）有限公司；佐劑ESSAIISA 206 CELL由Seppic公司贈(zèng)送。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參照NCBI登錄的日本血吸蟲SJCHGC06868蛋白編碼基因的核苷酸序列，利用排primer 5.0軟件，設(shè)計(jì)引物，分別在上、下游引物的5'端插入BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)（下劃線部分），上游引物為：CT GGATCC ATG CTG GAA CAA ACA CGC，下游引物為：AG CTCGAGA CTA ATC TCC TCC CCC GCG AA。引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 目的基因的克隆 以腹部貼片法按2000條尾蚴感染劑量感染新西蘭白兔，于感染后7、14、42 d剖檢，以肝門靜脈灌注法收集肝期童蟲。按TRIzol試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書提取總RNA并合成反轉(zhuǎn)錄cDNA。以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃ 變性 30 s，55 ℃ 退火 15 s，72 ℃ 延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。根據(jù)QIANGENE試劑盒的說明書從電泳膠中回收純化PCR產(chǎn)物。將純化的PCR產(chǎn)物以及質(zhì)粒pET32a分別用BamH I和XhoI雙酶切，分離目的基因片段和線性化載體DNA，用T4連接酶連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a-Sj068068并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta（DE3）。用含有0.5 μg/mL氨芐青霉素、0.34 μg/mL氯霉素的LB固體培養(yǎng)基鋪斑，挑取單克隆菌落，加入含相同抗生素的LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，小量制備質(zhì)粒DNA，用BamH I和Xho I雙酶切方法鑒定為陽(yáng)性克隆后，送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá) 用含有0.5 μg /mL氨芐青霉素、0.34 μg /mL氯霉素的LB培養(yǎng)基進(jìn)行表達(dá)菌的培養(yǎng)和蛋白表達(dá)。將測(cè)序正確的陽(yáng)性菌液接種置于5 mL 培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min搖床過夜培養(yǎng)。次日取500 μL培養(yǎng)菌液接種到5 mL含培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)2～3 h，再將5 mL的新鮮菌液加入到1 L培養(yǎng)基中，加入20% IPTG使其終濃度為1 mmoL/L，繼續(xù)培養(yǎng)4～5 h，4 ℃、6 000×g離心15 min，棄上清，加20 mL 1×PBS重懸細(xì)菌，-80℃/室溫反復(fù)凍融3次，冰浴超聲30 min,其間每超5 s 停10 s。4 ℃、6 000×g離心15 min，移取上清，進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.4 重組蛋白純化及抗原性鑒定 用上述表達(dá)菌裂解上清，按說明書操作程序用Ni-NTA HisBind Resin層析柱在非變性條件下分離純化重組蛋白（recombinant Sj068068，rSj068068），分步收集含目的蛋白的洗脫液，用SDS-PAGE電泳對(duì)純化的重組蛋白進(jìn)行鑒定，用紫外吸收法測(cè)定蛋白濃度。利用DNAStar生物學(xué)軟件分析重組蛋白的抗原性以及主要抗原決定簇，以感染日本血吸蟲14 d的兔血清為一抗，羊抗兔IgG-HRP為二抗，DAB為顯色劑，進(jìn)行Western blot分析。

1.2.5 動(dòng)物免疫試驗(yàn)及保護(hù)效果評(píng)估 將BALB/c雄性小鼠隨機(jī)分組。在新飼養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)1周后，隨機(jī)分成3組，每組10只。以ESSAIISA 206 CELL為佐劑，分別于d 0、14、28以背部皮下多點(diǎn)注射方法免疫，每次注射0.1 mL。重組抗原的免疫劑量為每次30 μg /鼠，三免后2周，腹部貼片法攻擊感染日本血吸蟲尾蚴[（40±2）條/只]，感染42 d后剖殺，以肝門靜脈灌注法收集成蟲，分別計(jì)數(shù)日本血吸蟲總數(shù)。收集肝臟，取右葉稱重后加入5 mL1×PBS，用均質(zhì)器按10 000 r/min均質(zhì)勻漿1 min，加入5 mL 10%NaOH，水浴56 ℃消化1～1.5 h，充分混勻后取20 μL解剖鏡下計(jì)數(shù)蟲卵數(shù)，每份樣本計(jì)數(shù)3次后取平均值，計(jì)算每克肝臟蟲卵數(shù)（eggs per gmm，EPG）。按下列公式計(jì)算減蟲率和減卵率：減蟲（卵）率（%）=[對(duì)照組平均蟲體數(shù)（EPG平均數(shù)） 實(shí)驗(yàn)組平均蟲體數(shù)（EPG平均數(shù)）]/對(duì)照組平均蟲體數(shù)（EPG平均數(shù)）× 100%。

1.2.6 血清抗體測(cè)定 于免疫前、每次免疫后一周斷尾采血，剖殺時(shí)眼眶采血，離心分離血清。以重組蛋白為檢測(cè)抗原，HRP-兔抗鼠IgG為第二抗體，TMB為顯色劑，用常規(guī)間接ELISA法[10]檢測(cè)各組血清中的特異性抗體。檢測(cè)時(shí)抗原包被濃度為10 μg/mL，每孔100μL；封閉液為含1.5%的牛血清白蛋白（BSA)的PBST（1×PBS，0.05%Tween-20）；待檢血清稀釋度為1:100，每孔100 μL；HRP-兔抗鼠IgG工作濃度為1:1000，每孔100 μL。

2 結(jié)果

2.1 Sj06868基因的克隆及生物信息學(xué)分析從7 d、14 d童蟲中擴(kuò)增到500 bp左右的DNA片段（圖 1），從42 d成蟲中未能擴(kuò)增到相應(yīng)片段。序列分析顯示該片段長(zhǎng)度為492 bp，編碼日本血吸蟲假想蛋白SJCHGC068068 C端的163個(gè)氨基酸，推導(dǎo)的理論分子量為18 kDa。和Genbank中公布的日本血吸蟲假想蛋白SJCHGC068068的編碼基因序列（登錄號(hào)：AY809313.1）相比較，同源性為98%，推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為96%；和GenBank中公布的登錄號(hào)為FN316908.1的日本血吸蟲假想蛋白全長(zhǎng)mRNA序列相比較，缺少N端15個(gè)氨基酸的編碼序列，同源性為97.6%，推導(dǎo)的氨基酸序列同源性均為96%（見圖2）。未發(fā)現(xiàn)其他物種的相似同源性序列。利用DNAStar生物學(xué)軟件工具分析目的蛋白的抗原性，結(jié)果顯示在11～40 aa、75～23 aa、147～164 aa等區(qū)域有良好的抗原性。

圖1 日本血吸蟲Sj06868基因PCR擴(kuò)增Fig. 1 PCR products of Sj06868

圖2 Sj06868基因的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the Schistosoma japonicum Sj06868 gene

2.2Sj068068基因的表達(dá) 重組質(zhì)粒pET32a-Sj068068轉(zhuǎn)化的大腸桿菌Rosetta（DE3）經(jīng)0.1mmol/L IPTG誘導(dǎo)后，獲得高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物為可溶性蛋白，分子量為36 kDa（圖3），用His柱純化后，純化蛋白的獲得率約為58.3 mg/L細(xì)菌培養(yǎng)物。

2.3 rSj068068的Western blot分析 用感染日本血吸蟲14 d的兔血清為一抗，羊抗兔IgGHRP為二抗，對(duì)純化的重組蛋白rSj068068進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果感染日本血吸蟲14 d的兔血清和純化重組蛋白rSj068068有特異性反應(yīng)，和未誘導(dǎo)的培養(yǎng)菌裂解液沒有反應(yīng)（圖4）。

圖3 純化重組蛋白rSj068068的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of the purified recombinant fusion protein rSj068068

圖4 重組蛋白rSj068068的western blot 分析Fig.4 Western blot analysis of purified protein

2.4 減蟲率和肝臟減卵率 重組抗原rSj068068與佐劑ESSAI ISA 206 CELL混合后免疫的BALB/c小鼠，攻擊感染后42 d，平均每鼠蟲荷數(shù)為16.50±3.89，與佐劑對(duì)照組和PBS對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05），減蟲率分別為31.63%、29.19%。免疫組平均每克肝臟組織含卵數(shù)為22 873.32±7 683.24，與佐劑對(duì)照組和PBS對(duì)照組相比，減卵率分別為55.36%、56.27%，差異極顯著（P<0.01）（表1）。

表1 重組抗原rSj068068對(duì)BALB/c小鼠的誘導(dǎo)保護(hù)性效果Table 1 Protective level of BALB/c mice immunized with rSj068068

2.5 抗體水平的測(cè)定 間接ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示，免疫組抗rSj068068特異性抗體在第一次免疫后即逐步增加，到第三次免疫后達(dá)到高峰并一直維持到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。佐劑對(duì)照組、PBS對(duì)照組在攻擊感染前均未產(chǎn)生抗rSj068068特異性抗體；攻擊感染后42 d，佐劑對(duì)照組、PBS對(duì)照組中的抗rSj068068特異性抗體也上升到免疫組水平（圖5）。

圖5 抗 rSj068068特異性抗體檢測(cè)Fig.5 Specific antibody response against rSj068068 in each group

3 討論

由于血吸蟲在宿主體內(nèi)不增殖，其感染所致的最大危害是血吸蟲排出的蟲卵沉積于肝臟引發(fā)免疫病理改變導(dǎo)致肝功能受損，通過免疫減少宿主體內(nèi)蟲荷量和蟲卵產(chǎn)量，可以達(dá)到減輕病變和減少傳播機(jī)會(huì)。WHO認(rèn)為只要達(dá)到40%減蟲率或減卵率就有一定的應(yīng)用前景[11]。在本實(shí)驗(yàn)室前期研究中，用含有Sj068068基因片段噬菌體展示抗原誘導(dǎo)了24.28%的減蟲率以及45.52%肝臟蟲卵減少率。在本研究中，重組抗原rSj068068免疫小鼠，與佐劑對(duì)照組相比，免疫組獲得了31.63%減蟲率和55.36%肝臟減卵率，與PBS對(duì)照組相比，免疫組獲得了29.79%減蟲率和56.27%的肝臟減卵率?？梢姡琒j068068基因及其產(chǎn)物在抗血吸蟲疫苗研究方面具有進(jìn)一步研究的潛質(zhì)。

本研究從7 d、14 d童蟲的mRNA中擴(kuò)增到Sj068068基因的DNA片段，從42 d成蟲中雖經(jīng)多次PCR擴(kuò)增亦未能得到相應(yīng)片段，顯示Sj068068基因是血吸蟲童蟲期高表達(dá)基因。對(duì)該基因的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行BLASTn分析，發(fā)現(xiàn)其只與GenBank中公布的日本血吸蟲假想蛋白編碼基因序列及推導(dǎo)的氨基酸序列有較高同源性，在其他物種中未找到相似同源性序列，也沒有發(fā)現(xiàn)保守序列和相關(guān)功能結(jié)構(gòu)域，推測(cè)該基因是日本血吸蟲特有的未知基因。該基因的噬菌體展示產(chǎn)物能被東方田鼠肝臟裂解物識(shí)別[6]，而東方田鼠抗血吸蟲特性主要表現(xiàn)為對(duì)其體內(nèi)血吸蟲童蟲具有殺滅作用。因此，該基因可能對(duì)血吸蟲生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用。

長(zhǎng)期以來，我國(guó)家畜血吸蟲病診斷主要采用以糞便蟲卵孵化為主的病原學(xué)檢測(cè)和以蟲卵可溶性抗原為診斷抗原的血清學(xué)診斷技術(shù)，后者主要為間接血凝試驗(yàn)。病原學(xué)診斷費(fèi)工、費(fèi)時(shí)且檢出率較低；蟲卵抗原制備難度大，應(yīng)用蟲卵可溶性抗原建立的診斷技術(shù)難以開展早期診斷，也難以區(qū)分既往感染和現(xiàn)癥感染。尋找理想的診斷抗原特別是基因工程抗原依然是當(dāng)前研究的一個(gè)重點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，重組抗原rSj068068能被感染日本血吸蟲14 d的兔血清識(shí)別；免疫組、佐劑對(duì)照組、PBS對(duì)照組特異性抗體檢測(cè)結(jié)果表明，兩個(gè)對(duì)照組在感染血吸蟲42 d后的特異性抗體也上升到免疫組水平。因此，應(yīng)用重組抗原rSj068068開展血吸蟲感染的診斷特別是早期診斷的研究可以作為下一步的嘗試。

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