上海地區(qū)豬群中H1N1甲型流感抗體檢測

李凱航，葛菲菲，薛 霞，鞠龔訥，周錦萍

(上海市動物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103)

2009年3月，一種新型H1N1甲型流感從墨西哥開始流行并迅速傳播，至2009年5月19日，世界衛(wèi)生組織（WHO）官方網(wǎng)站已經(jīng)公布全球有40個國家和地區(qū)共9830例患者感染該流感[1]。從基因的最初來源看，2009年H1N1甲型流感（以下簡稱新甲流）病毒（Influenza A virus H1N1 subtype in 2009）含有人、禽和豬的流感病毒基因，目前已經(jīng)成為全球人群中甲型流感病毒優(yōu)勢流行株。該病毒血凝素（haemagglutini，HA）由RNA第4區(qū)段編碼，是甲型流感病毒主要抗原基因之一。據(jù)報(bào)道，新甲流病毒的HA基因與我國流行的豬流感病毒（Swine influenza virus，SIV）HA基因同源性僅為76%～77%，重要抗原位點(diǎn)50%以上發(fā)生了變化[3]，因此，可以運(yùn)用血凝抑制實(shí)驗(yàn)（hemagglutination inhibition，HI）進(jìn)行新甲流病毒抗體檢測。同時，鑒于兩者之間的可能存在的交叉反應(yīng)，采用商品化ELISA試劑盒平行檢測豬流感病毒抗體。

目前，國內(nèi)對于新甲流病毒在人群中流行后是否會對豬群造成感染，豬群中的該病的感染現(xiàn)狀、流行規(guī)律以及抗體水平等方面的相關(guān)報(bào)道較少。本文通過對上海地區(qū)豬群進(jìn)行新甲流抗體檢測，探討不同飼養(yǎng)模式疫病變化規(guī)律，以期為新甲流病毒在豬群中的流行情況研究提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 豬血清樣品 2007～2010年共采集豬血清410份，來自上海市9個區(qū)縣41個養(yǎng)殖場戶，-30 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 新甲流感病毒血凝抑制試驗(yàn)用甲醛滅活抗原 由上海市疾病預(yù)防控制中心惠贈，為新甲流病毒特異性抗原；H1N1亞型豬流感ELISA試劑盒購自美國IDEXX公司，批號：09332-BF471；sunrise酶標(biāo)儀為TECAN公司產(chǎn)品。

1.1.3 1%雞紅細(xì)胞懸液 無菌采集3只公雞血液，與等體積阿氏液混勻，用0.01mol/L PBS(pH7.2)液洗滌3次，注意棄去白細(xì)胞層，每次均以1000×g離心10min，按1%體積分?jǐn)?shù)制備紅細(xì)胞懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 非特異性因子祛除 采用雞紅細(xì)胞泥吸附法，在血清樣品中加入終濃度為20%的雞紅細(xì)胞泥，混勻，4 ℃靜置過夜后，1000×g離心，取上清進(jìn)行檢測。

1.2.2 血凝（HA）試驗(yàn)（微量法） 在96孔V型微量反應(yīng)板1～12孔分別加入25 μL PBS。吸取25μL抗原加入第1孔，混勻，然后將第1孔倍比稀釋至第11孔，從第11吸取25μL棄去。每孔加入25 μLPBS，再分別加入25 μL 制備的1%雞紅細(xì)胞懸液，震蕩混勻，室溫（20 ℃～25 ℃）靜置40 min后觀察結(jié)果。結(jié)果判定：將板傾斜，觀察紅細(xì)胞有無呈淚滴狀流淌，完全血凝的抗原最高稀釋倍數(shù)代表一個血凝單位。

1.2.3 血凝抑制（HI）試驗(yàn)（微量法） 根據(jù)1.2.2結(jié)果配置4單位的抗原。以完全血凝的抗原最高稀釋倍數(shù)為終點(diǎn)，終點(diǎn)稀釋倍數(shù)除以4即為含4單位的抗原稀釋倍數(shù)。在96孔V型微量反應(yīng)板的1～11孔加入25 μL PBS，第12孔加入50 μL PBS。將第1孔倍比稀釋至第10孔，從第10孔吸取25 μL棄去。1～11孔分別加入4單位抗原25μL，室溫靜置30 min。 每孔加入25 μL 1%雞紅細(xì)胞懸液，混勻，靜置40 min。 結(jié)果判定：以完全抑制4單位抗原的血清最高稀釋倍數(shù)為HI效價，HI效價≥5判為陽性。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 使用前，將濃縮的洗滌液恢復(fù)至室溫，搖動混勻，使析出的鹽類完全溶解。濃縮洗滌液用去離子水按1:10稀釋，樣品用樣品稀釋液進(jìn)行40倍稀釋。取出SIV抗原包被板，記錄樣品位置。陰陽對照各加2孔，每孔100 μL，對照無需稀釋。加100 μL稀釋好的樣品至相應(yīng)的孔，室溫（20 ℃～25 ℃）孵育30 min。 PBST洗板5次，甩干，每孔加入100μL酶標(biāo)抗豬抗體，室溫孵育30 min。 PBST洗板5次，甩干，每孔加入100 μL底物溶液，室溫孵育15 min。最后，每孔加入100 μL終止液，終止反應(yīng)。在650 nm測量和記錄樣品和對照的吸光值。 結(jié)果判定：SIV抗體存在與否，通過計(jì)算樣品對陽性的S/P值來決定：如S/P＜0.4，判為血清SIV-H1N1抗體陰性；如S/P≥0.4，判為血清SIV-H1N1抗體陽性。

2 結(jié)果與討論

2.1 按5個時間點(diǎn)（2007年11月、2008年11月、2009年5月、2009年11月、2010年5月）依次將新甲流和豬流感檢測數(shù)據(jù)劃分為5組。檢測結(jié)果顯示，2007年11月的養(yǎng)殖場戶豬血清中未檢出新甲流病毒抗體； 2008年11月和次年5月的樣品中存在6.7%～13.3%的新甲流病毒抗體水平。2009年新甲流病毒流行后，豬血清樣品中檢出的病毒抗體水平持續(xù)上升，2009年11月為23.3%，2010年5月達(dá)到46.7%。同時檢測H1N1豬流感病毒抗體，計(jì)算5個小組內(nèi)的豬流感病毒抗體（S/P值）和新甲流病毒抗體（HI）間的相關(guān)系數(shù)，介于-0.31～0.325，具體數(shù)據(jù)和趨勢變化見表1和圖1。

不同飼養(yǎng)模式的養(yǎng)殖場中，新甲流HI抗體水平變化明顯。2007年11月，所有養(yǎng)殖場戶豬群中均未檢測到HI抗體，但至2010年5月，散養(yǎng)肉豬戶豬群HI抗體升至30%，商品肉豬場升至50%，種豬場升至66.7%（見表2），上升幅度為：種豬場＞商品肉豬場＞散養(yǎng)肉豬戶（見圖2）。

2.2 新甲流病毒基因來源于北美古典型豬流感病毒、北美禽源流感病毒、歐亞豬流感病毒和人季節(jié)性流感病毒，其中決定病毒血凝性的HA基因來源于北美古典型豬流感病毒，與亞洲豬源甲型流感病毒同源性較遠(yuǎn)[3]。Brown等[2]研究表明，甲型流感病毒HA基因氨基酸序列中的21個氨基酸為其重要抗原表位。謝佳新等[3]將這21個抗原表位與豬源甲型流感病毒相比較，發(fā)現(xiàn)新甲流病毒HA基因抗原表位與豬源病毒抗原表位有12處不同。正是基于以上的抗原變異基礎(chǔ)，本文所用血凝抑制試驗(yàn)抗原能夠?qū)⑿录琢骺贵w與我國流行的同亞型豬流感病毒抗體加以區(qū)分。結(jié)果顯示，兩種疫病抗體的相關(guān)性很低，從側(cè)面證明了所用抗原與同亞型豬流感無交叉性或交叉性很低。

表1 新甲流和豬流感抗體水平及相關(guān)系數(shù)表Table 1 Correlation coefficient of the antibody against new type A In fl uenza virus and Swine in fl uenza virus

圖1 新甲流和豬流感抗體水平變化趨勢圖Fig.1 Variation trend of the antibody elvel against new type A Influenza virus H1N1 subtype and Swine influenza virus

表2 不同飼養(yǎng)模式豬血清中新甲流抗體水平表Table 2 Antibody level against new type A In fl uenae Virus in different breeding model

圖2 不同飼養(yǎng)模式豬血清中新甲流抗體變化趨勢圖Fig.2 Change trend of antibody against new type A influenza Virus in different breeding model

2.3 新甲流HI抗體檢測結(jié)果顯著性檢驗(yàn)顯示，1組和2組之間差異不顯著，而2組和3、4、5組之間均存在顯著差異（P<0.05）。由此可見，新甲流病毒因?yàn)闉?009年5月這一時間點(diǎn)前后在豬群中感染，這一現(xiàn)象與人群感染情況趨同，說明該病毒不僅能在人群中感染，也能在豬群中廣泛傳播。新甲流爆發(fā)后，國內(nèi)人群中新甲流病毒陽性率從4.4%至9%不等[5,6]，這一水平遠(yuǎn)低于本實(shí)驗(yàn)中豬群的抗體陽性水平。這種現(xiàn)象的形成一方面是因?yàn)槿巳航臃N了甲型流感疫苗，控制了該病的傳播；另一方面是由于豬群飼養(yǎng)密集，易于感染病毒。而豬群是否是感染人的源頭，該病是否還感染其他畜禽，這些問題尚有待進(jìn)一步研究。

2.4 本文首次證實(shí)上海地區(qū)豬群不僅存在不同程度上的新甲流病毒感染，而且感染后的抗體水平高低與豬群的飼養(yǎng)模式有關(guān)。豬群飼養(yǎng)周期以及群飼養(yǎng)密度情況顯著影響抗體水平，豬群飼養(yǎng)周期長、養(yǎng)殖密度大會增加新甲流病毒感染幾率，導(dǎo)致感染抗體水平升高。

本研究首次將血凝抑制試驗(yàn)應(yīng)用于豬體內(nèi)新甲流病毒抗體檢測，為新甲流病在家畜中的流行病學(xué)研究打下了基礎(chǔ)。在人畜共患病的流行過程中，人群中的病毒流行株消失后，往往會在家畜和寵物等動物體內(nèi)保持很長時間。由于豬體可以同時感染不同來源、不同亞型的流感病毒，是人、禽、豬流感病毒間發(fā)生基因重組的“混合器”，是人流感病毒的保存宿主，在適當(dāng)?shù)臈l件下，該病毒很有可能會重新在人群中造成流行或形成新的流感病毒株重新感染人群。因此，開展對豬體內(nèi)新甲型流感病毒感染情況的研究，具有非常重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

[1]World Health Organization. Influenza A (H1N1)update 33,19, May, 2009[EB/OL]. http :/ /www. who. int/ csr/ don/2009205219/ en/index. html

[2]Brown I H, Ludwig S, Olsen C W, et al. Antigenic and genetic analyses of H1N1 influenza A viruses from European pigs [J]. J Gen Virol, 1997, 78: 553-562.

[3]謝佳新, 殷建華, 李淑華, 等. 2009 年新型甲型H1N1流感病毒血凝素基因進(jìn)化分析[J]. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2009, 30(6): 613-617.

[4]王國戧,牛菊霞,賈安奎. 2009年中國流行的甲型流感病毒(H1N1)血凝素特征分析[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志,2009, 21(11): 998-1000.

[5]金秀國, 李浩孺. 應(yīng)用EIA法檢測舟山地區(qū)獻(xiàn)血者甲型H1N1流感病毒抗體[J]. 中國輸血雜志, 2010, 23(3):178-179.

[6]林藝, 劉倜, 王爽, 等. 山東省甲型H1N1流感隱性感染者抗體調(diào)查[J]. 預(yù)防醫(yī)學(xué)論壇, 2010 (4): 293-294.