豬源TTV Taqman實(shí)時熒光定量PCR檢測方法的建立和應(yīng)用

侯軍委，周艷君，王礞礞，李國新，于 海，童光志

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

TTV（Torque teno virus，TTV）又稱輸血傳播病毒（Transfusion Transimitted Virus），該病毒最初是由日本學(xué)者Nishizawa等采用代表性差異分析法從一名輸血后發(fā)生急性感染的非甲～戊型肝炎患者血清中發(fā)現(xiàn)的[1]。此后，很多國家對本國不同人群中TTV感染進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)人群的TTV DNA陽性率一般在10%以上[2]。隨后發(fā)現(xiàn)該病毒在自然界各種動物中存在廣泛，能感染人類、靈長類和家養(yǎng)動物包括豬、雞、牛、羊、貓和狗[3]。

TTV是一種無囊膜的單股負(fù)鏈環(huán)狀DNA病毒，目前，該病毒被歸為圓環(huán)病毒科，指環(huán)病毒屬[4]。感染不同動物的TTV基因組長度也不同，感染人和猿的TTV基因組長度為3.7～3.9 kb，感染豬和狗的TTV基因組長度分別為2.8 kb和2.9 kb左右，而在貓體內(nèi)獲得的TTV其基因組長度則約為2.1 kb[5]。目前對于TTV的編碼基因尚未完全確定，有人認(rèn)為TTV含有4個放閱讀框（ORF1～ORF4）[6]，也有人認(rèn)為含有6個開放閱讀框（ORF1～ORF6）[7]。

已知感染豬的TTV共兩種基因型，即TTV1和TTV2[8]。有學(xué)者對西班牙豬群感染TTV的情況進(jìn)行了回溯性調(diào)查，發(fā)現(xiàn)從1985年到2005年的所有年份均檢出TTV，母豬和肉豬中，TTV1感染率分別為34.2%和30.9%，TTV2感染率分別為46.6%和62.8%，TTV1和TTV2共感染則分別為19.8%和24.5%[9]。有報道證實(shí)，歐洲野豬群中TTV感染的總陽性率為84%，其中TTV1和TTV2陽性率分別為58%和66%[10]。目前，應(yīng)用于豬源TTV檢測的方法仍然以常規(guī)PCR為主，但常常敏感性不夠；套式PCR雖然敏感性更高，但容易出現(xiàn)假陽性。近年來實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、快速高效等特點(diǎn)在病原檢測以及基因表達(dá)水平分析等方面得到了廣泛應(yīng)用。本研究旨在建立針對豬源TTV1和TTV2的實(shí)時熒光定量PCR檢測方法，為病毒檢測以及病毒在體內(nèi)復(fù)制等領(lǐng)域的研究提供快速、簡便和可靠的技術(shù)工具。

1 材料與方法

1.1 病料與核酸樣品 檢測病料來自內(nèi)蒙古和廣西的某豬場；帶有TTV1和TTV2全長的質(zhì)粒Psk-TTV1和Psk-TTV2由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）、 豬 瘟 病 毒（Classical swine fever virus, CSFV）、豬2型圓環(huán)病毒（Porcine circovirus type 2, PCV2）、 豬 流 感 病 毒（Swine influenza virus，SIV）由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試劑和儀器 Ex Taq DNA聚合酶、Hot Start Ex Taq、dNTP、DNA Marker、pMD18-T載體等均購自大連寶生物有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒和基因組DNA提取試劑盒均購自上海華舜生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。主要儀器有Mastercycler ep realplex熒光定量PCR儀（Eppendorf公司）。

1.3 引物和探針 應(yīng)用MegAlign軟件對本實(shí)驗(yàn)室分離的毒株及GenBank數(shù)據(jù)庫中的TTV1和TTV2全長核苷酸序列分別進(jìn)行同源性分析，利用Primer Express 3.0軟件分別在TTV1和TTV2的UTR高度保守區(qū)域設(shè)計并合成一對特異性引物和TaqMan熒光探針。探針的5'端標(biāo)記的熒光報告基團(tuán)是FAM，3'端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為BHQ。TTV1的引物序 列 為QF1：5'- TCCGAATGGCTGAGTTTATGC-3'，QR1：5'- CCGCCCAGTCGCTAGACA-3'，TTV1的 TaqMan探 針 序 列 為：FAM1-CCAGCGGTAGACAGAA ，BHQ1， 擴(kuò) 增 片 段長度為58 bp；TTV2的引物序列為QF2：5'-TTTATGCCGCTGGTGGTAGAC -3'，QR2：5'-CCCCTTGACTCCGCTCTCA -3'，TTV2的 TaqMan探針序列為：FAM2- AACAGAGCTGAGTGTCTAA，BHQ2，擴(kuò)增片段長度為86 bp。另外，針對TTV1和TTV2的UTR保守區(qū)域分別設(shè)計了一對常規(guī)PCR引物用于制備陽性標(biāo)準(zhǔn)品, 其中，TTV1的引物序列 為 PF1：5'-GCAGTTCCGAATGGCT -3'，PR1：5'-CTTCATGTAGGCCCTC -3'； TTV2的引物序列為 PF2：5'- AGACGAATGGCTGAGTT -3'，PR2：5'-GGGCCCGGTTCCGCTGG -3'。 引 物 由 Invitrogen公司合成，探針由上海基康生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 病毒基因組DNA的提取 按照Tissue/Cell gDNA Mini Kit試劑盒說明書提取病料組織中的病毒基因組DNA。

1.5 陽性標(biāo)準(zhǔn)模板的制備 以PF1和PR1為引物，擴(kuò)增Psk-TTV1的UTR保守序列區(qū)；以PF2 和PR2為引物，擴(kuò)增Psk-TTV2的UTR保守序列區(qū)。二者反應(yīng)條件相同：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5μL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果?；厥占兓康钠?，分別與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α大腸埃希氏菌中，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和序列測定，挑選測序結(jié)果正確的質(zhì)粒并測定其濃度，獲得pMD18-TTV1和pMD18-TTV2質(zhì)粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品模板，根據(jù)公式計算出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 用DEPC水對陽性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行10倍系列稀釋，TTV1取6個稀釋度作為標(biāo)準(zhǔn)模板，TTV2取9個稀釋度作為標(biāo)準(zhǔn)模板，分別優(yōu)化引物和探針的反應(yīng)濃度、Tm值及反應(yīng)時間，進(jìn)行熒光定量RT-PCR反應(yīng) ，計算Ct值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 特異性試驗(yàn) 應(yīng)用建立起來的兩種熒光定量PCR檢測方法分別對本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的TTV1全長（TTV1-FJ2） 和 TTV2全 長（TTV2-GD9） 及CSFV、 PCV2、PRRSV、SIV 進(jìn)行特異性試驗(yàn)。

1.8 敏感性試驗(yàn) 用100copies /uL ～107copies /μL陽性標(biāo)準(zhǔn)品做熒光定量PCR，進(jìn)行敏感性試驗(yàn)。1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取3份病毒含量不同的樣品進(jìn)行批間重復(fù)性試驗(yàn)和批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)。

1.10 病料的的檢測 應(yīng)用建立起來的TaqMan實(shí)時熒光定量PCR鑒別TTV1和TTV2的檢測方法，檢測采集自內(nèi)蒙古、廣西等地豬場豬只的組織臟器、全血樣品共計44份，對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將pMD18-TTV1質(zhì)粒經(jīng)10倍系列稀釋至1.88×101～1.88×106copies/μL共6個濃度作為標(biāo)準(zhǔn)品，每個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品做3個重復(fù)；將pMD18-TTV2質(zhì)粒經(jīng)10倍系列稀釋至8.12×102～8.12×109copies/μ L共8個濃度作為標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)。二者反應(yīng)體系均為 25μL，包括 10×Ex Taq Buffer（Mg2+Plus）2.5μL，dNTP mix（各 2.5 mmol/L）2.5μL ；上、下游引物（10 pmol/ L）各 1 μL ，探針(10 pmol/L)0.5 μ L ；Ex Taq SH (5 U/μL )0.2 μL , 模板 (質(zhì)粒或 cDNA）5 μL ，DEPC 水 12.3 μL 。二者反應(yīng)條件一致：95 ℃變性 2 min，以 95 ℃變性 15 s，55 ℃ 退火 15 s ，68 ℃ 延伸 20 s，擴(kuò)增 45 個循環(huán)，在 68 ℃進(jìn)行單點(diǎn)熒光檢測。結(jié)果TTV1和TTV2的各濃度均有很好的線性關(guān)系，陰性對照無擴(kuò)增反應(yīng)，其中，TTV1得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y=－3.313×LOG（X）+46.75，相關(guān)系數(shù)R2=0.984；擴(kuò)增效率E=1.00，見圖 1（A和B）；TTV2得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y=－3.449×LOG（X）+50.16，相關(guān)系數(shù)R2=0.995；擴(kuò)增效率E=0.95，見圖 2（A和B）。

圖1 實(shí)時熒光定量PCR檢測豬源TTV1的動力學(xué)曲線(A)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(B)Fig.1 Amplification plots (A)and standard curve (B)of real-time fluorescent quantitative PCR for TTV1

圖2 實(shí)時熒光定量PCR檢測豬源TTV2的動力學(xué)曲線(A)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(B)Fig.2 Amplification plots (A)and standard curve (B)of real-time fluorescent quantitative PCR for TTV2

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果 以對照病毒PRRSV、CSFV、PCV2、SIV和帶有TTV全長的質(zhì)粒TTV1-FJ2、TTV2-GD9為模板用建立起來的兩種熒光定量PCR做檢測，結(jié)果顯示，針對TTV1的檢測方法檢測PRRSV、CSFV、PCV2、SIV和TTV2-GD9為陰性，檢測TTV1-FJ2為陽性（圖3）；針對TTV2的檢測方法檢測PRRSV、CSFV、PCV2、SIV和TTV1-FJ2為陰性，檢測TTV2-GD9為陽性（圖4），說明本方法具有很好的特異性。

圖3 TTV1熒光定量PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Specificity test of the real-time fluorescent quantitative PCR for TTV1

圖4 TTV2熒光定量PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig. 4 Specificity test of the real-time fluorescent quantitative PCR for TTV2

2.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果 將pMD18-TTV1和pMD18-TTV2陽性質(zhì)粒按照109-100分別倍比稀釋作為模板，進(jìn)行TaqMan實(shí)時熒光定量PCR檢測，兩種檢測方法的最低檢出量均為10 copies/μL（表1）。

表1 Taqman 實(shí)時熒光定量PCR的敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Sensitivity analysis of the Taqman real-time fl uorescentquantitative PCR

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 對含量不同的TTV1和TTV2病毒感染樣品各3份分別做5個批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)，變異系數(shù)均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好（見表2和表3）。

表2 實(shí)時熒光定量PCR檢測TTV1批內(nèi)及批間重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Intra- and inter-batch reproducibility of real-time fl uorescent quantitative PCR assay for TTV1

表3 實(shí)時熒光定量PCR檢測TTV2批內(nèi)及批間重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Intra- and inter-batch reproducibility of real-time fl uorescent quantitative PCR assay for TTV2

2.5 樣品檢測結(jié)果 應(yīng)用建立起來的TaqMan實(shí)時熒光定量PCR鑒別TTV1和TTV2的檢測方法，檢測采集自內(nèi)蒙古、廣西等地豬場豬只的組織臟器、全血樣品共計44份，結(jié)果顯示21份樣品TTV1陽性（47.73%），31份樣品TTV2陽性（70.45%），14份樣品二者均陽性（41.82%），6份樣品二者均陰性（13.64%）（表4）。

表4 應(yīng)用熒光定量PCR檢測豬組織和血液樣品中TTV的結(jié)果Table 4 Detection result of samples with real-time fl uorescent quantitative PCR for TTV1 and TTV2

3 討論

TTV雖然在豬中廣泛存在，卻被認(rèn)為是沒有致病性的孤兒病毒[14]。通過PCR對豬的組織樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其DNA主要存在于肺、淋巴結(jié)、扁桃體和回腸中[15]。王礞礞等[16]首次對2008～2009年采集自國內(nèi)7個省份的258份組織樣品進(jìn)行了TTV感染情況調(diào)查，結(jié)果證實(shí)在我國的豬群中也存在TTV的感染，其中TTV1感染的陽性率為37.6%，TTV2感染陽性率為82.6%，TTV1和TTV2的共感染率為38.4%。Kekarainen等[17]在檢測豬血清中發(fā)現(xiàn)TTV的出現(xiàn)和PCV2的流行具有一定的相關(guān)性，在斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）感染的豬中，TTV的感染率為97%，在沒有PMWS感染的豬中TTV的感染率為78%。研究表明PCV2是一種可以和豬共存時間較長的一種病毒，是PMWS的主要誘因之一[18]。王礞礞等[19]對國內(nèi)豬群中TTV與PCV2共感染的流行病學(xué)調(diào)查顯示，PCV2和TTV1共感染率為36.4%， PCV2與TTV2共感染率為74.8%。

目前，檢測豬源TTV的方法主要有普通PCR[17]、套式PCR[20]、半套式PCR[21]和滾環(huán)擴(kuò)增[22]等方法。普通PCR敏感性較差且不能定量，套式PCR、半套式PCR和滾環(huán)擴(kuò)增耗時較長，而熒光定量PCR檢測方法不僅可以克服上述缺點(diǎn)，而且還可以應(yīng)用于病毒的復(fù)制等領(lǐng)域的研究。

本研究建立的針對豬源TTV1和TTV2的兩種Taqman 實(shí)時熒光定量PCR方法，通過特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果表明，這兩種方法均具有較高的靈敏性，最低可檢測到10 copies/μL的陽性標(biāo)準(zhǔn)品；特異性強(qiáng)，對TTV1和TTV2檢測結(jié)果為陽性，但對PRRSV、CSFV、PCV2、SIV的檢測結(jié)果均為陰性；重復(fù)性好，對分別含有TTV1和TTV2的各3份病毒樣品進(jìn)行5個批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)，變異系數(shù)均小于3%。Taqman 實(shí)時熒光定量PCR與SYBR Green PCR和常規(guī)PCR相比，具有更好的特異性和靈敏性，可以用于豬源TTV的定性和定量檢測，實(shí)時了解樣品中的病毒含量，在豬源TTV的診斷中具有一定的實(shí)用價值。

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