三種原理苦參結(jié)腸靶向微丸在大鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)及釋藥性能的對(duì)比研究

謝興亮，韓麗，楊明

苦參性苦寒，歸心、肺、腎、大腸經(jīng)，具有清熱燥濕、祛風(fēng)殺蟲的功效，主治濕熱下注大腸所致瀉痢、腸風(fēng)便血等，臨床用其灌腸治療結(jié)腸炎[1]，療效肯定?，F(xiàn)代研究表明，苦參所含苦參堿、氧化苦參堿等成分，具有抑制炎癥介質(zhì)釋放、降低毛細(xì)血管通透性、抑制肉芽組織增生、保護(hù)胃腸道黏膜、止瀉、免疫抑制等多種藥理作用[2]，為其治療結(jié)腸炎的主要藥效成分，兩者口服吸收后在結(jié)腸分布很少，其藥理效應(yīng)不與血藥濃度直接相關(guān)[3-4]，而與效應(yīng)室——結(jié)腸的藥物濃度呈良好相關(guān)性，因此采用結(jié)腸定位給藥，可顯著提高結(jié)腸病灶部位苦參成分的濃度從而充分發(fā)揮其藥效。

根據(jù)結(jié)腸靶向給藥系統(tǒng)的研究進(jìn)展，我們?cè)谇捌谘芯恐幸钥鄥A、氧化苦參堿為原料，設(shè)計(jì)、制備了 3 種原理結(jié)腸靶向微丸：① pH 敏感單層型。以 Eudragit S100 為成膜劑設(shè)計(jì)單層包衣，利用其可在 pH 7.0 以上的回腸末段環(huán)境中溶解的特性從而實(shí)現(xiàn)結(jié)腸定位釋藥。② pH 敏感雙層型。外層以Eudragit L100 為包衣對(duì)抗胃液的溶蝕，保護(hù)微丸抵達(dá)小腸，進(jìn)入小腸后外層 Eudragit L100 即溶解，此時(shí)內(nèi)層 Eudragit E100 包衣暴露于小腸的弱堿性環(huán)境中，由于 Eudragit E100 只溶于酸性環(huán)境因而可將藥物成功轉(zhuǎn)運(yùn)至結(jié)腸；有研究表明，潰瘍性結(jié)腸炎（UC）患者的升結(jié)腸呈酸性環(huán)境，檢測(cè)其最低pH 值為2.3，顯著低于小腸 pH 值[5]，因此，Eudragit E100 包衣可在 UC 患者酸性的結(jié)腸環(huán)境中完全溶解從而釋放出藥物。③ pH-酶觸發(fā)雙控型。內(nèi)層以 Eudragit E100 為隔離衣；中間層以殼聚糖為包衣，殼聚糖可被結(jié)腸菌群分泌的糖苷酶特異性降解；外層以 Eudragit L100 為包衣，以對(duì)抗胃液對(duì)殼聚糖膜的侵蝕。3 種方案的靶向微丸各有其設(shè)計(jì)依據(jù)，前期我們已對(duì)其體外釋藥性能進(jìn)行了對(duì)比研究[6]，在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步開展了 3 種靶向微丸在大鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)及釋藥性能研究，以探討其體內(nèi)靶向性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 pH 敏感單層型（I 型）、pH敏感雙層型（II 型）、pH-酶觸發(fā)雙控型（III 型）苦參結(jié)腸靶向微丸以及苦參丸心均為江西中醫(yī)學(xué)院現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制，其中苦參堿與氧化苦參堿總含量依次為145、130、96、189 mg/g；苦參堿對(duì)照品（批號(hào) 110805-200804）和氧化苦參堿對(duì)照品（批號(hào) 110780-200806）均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；乙腈購(gòu)自美國(guó)如意公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。C-18 色譜分析柱（250mm×0.46mm）購(gòu)自北京迪馬科技有限公司；高效液相色譜儀（P680 HPLC Pump 泵、UVD170U紫外檢測(cè)器）為美國(guó)戴安（DIONEX）公司產(chǎn)品。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康 SD 大鼠 108 只，雄性，7～8 周齡，體重 220～250 g，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK（川）2008-11。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥方法 取 3 種苦參結(jié)腸靶向微丸及苦參丸心各約 150 mg，精密稱定重量，并對(duì)微丸計(jì)數(shù)（以 N總表示）。按給藥不同將 SD 大鼠隨機(jī)分為4 組：I、II、III 型苦參結(jié)腸靶向微丸組和苦參丸心組，每組每時(shí)間點(diǎn)各 3 只。

大鼠禁食不禁水 12 h 后，采用乙醚吸入麻醉，通過(guò)胃插管（內(nèi)徑 2.0mm、外徑 3.0mm）將各微丸完整送入體內(nèi)，再按 5 ml/只灌服蒸餾水?？鄥⑼栊慕M分別于給藥后 0.5、1、2 h，3 種苦參結(jié)腸靶向微丸組分別于給藥后 1、2、3、4、6、8、10、12、16、20、24 h 等時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，打開腹腔，分別取胃、小腸（幽門至回盲部）、結(jié)腸（回盲部至肛門）各段消化道，備用。

1.2.2 微丸在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)分布 用手術(shù)剪縱向剖開大鼠胃、小腸、結(jié)腸，在鑷子輔助下，觀察各段消化道中微丸的外觀性狀，并分別對(duì)各段內(nèi)微丸計(jì)數(shù)（以 NX表示）。按照“分布率（%）= NX/N總×100%”，計(jì)算給藥后不同時(shí)間點(diǎn)各類微丸在大鼠體內(nèi)各段消化道的分布率。

1.2.3 HPLC 法含量測(cè)定考察

⑴HPLC 色譜條件：DiamonsiL C-18 色譜分析柱，流動(dòng)相為5∶95 配比的乙腈-pH3.0 磷酸緩沖液（水∶三乙胺∶磷酸 = 500∶1∶1），流速為1 ml/min，柱溫 40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為205 nm，靈敏度 0.01 AUFS。于此條件下，吸取苦參堿、氧化苦參堿對(duì)照品溶液、苦參微丸供試品溶液各 10 μl，所得色譜圖顯示待測(cè)成分色譜峰分離良好（圖1）。

圖1 HPLC 色譜圖（A：苦參堿對(duì)照品；B：氧化苦參堿對(duì)照品；C：微丸）Figure 1 The HPLC chromatogram (A: The reference substance of matrine; B: The reference substance of oxymatrine;C: Pellets)

⑵線性范圍考察：苦參堿對(duì)照品溶液在進(jìn)樣量0.067～0.402 μg 范圍內(nèi)，回歸方程為A= 525.78 C+ 3.324，r= 0.9994，與峰面積線性關(guān)系良好；氧化苦參堿對(duì)照品溶液在進(jìn)樣量 0.1348～0.8088 μg 范圍內(nèi)，回歸方程為A= 59.588 C － 2.2951，r=0.9993，與峰面積線性關(guān)系良好。

⑶擬定的苦參微丸供試品溶液制備方法：用鑷子小心取出大鼠胃腸道內(nèi)微丸，置濾紙上滾動(dòng)吸去表面黏附物，研細(xì)，精密加入甲醇 25 ml，洗滌并轉(zhuǎn)移至具塞三角瓶中，稱量，超聲提?。?0 kHz，250 W）30min，冷卻，稱量，加甲醇補(bǔ)足損失，搖勻，精密吸取 1 ml 上清液，置 10 ml 量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，0.45 μm 濾過(guò)即得。

此外，精密度、供試品溶液穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率等實(shí)驗(yàn)考察結(jié)果均符合含量測(cè)定要求。

1.2.4 微丸體內(nèi)累積釋放度及定位釋藥性能的評(píng)價(jià) 采用 HPLC 法測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)大鼠消化道內(nèi)微丸中苦參堿、氧化苦參堿的殘留總量（以 M剩表示），根據(jù)給藥前微丸中苦參堿、氧化苦參堿的總含量（以 M總表示），按照“R（%）=（M總－M剩）/ M總×100%”，計(jì)算在給藥后不同時(shí)間點(diǎn)各微丸在大鼠體內(nèi)的累積釋放度（R），并以時(shí)間為橫坐標(biāo)、累積釋放度為縱坐標(biāo)繪制釋藥曲線。

此外，根據(jù)各微丸在胃與小腸的累積釋放度（R胃+小腸）以及結(jié)腸累積釋放度（R結(jié)腸），按照“Ind=（R結(jié)腸－ R胃+小腸）/ R胃+小腸”，計(jì)算定位釋藥指數(shù)（Ind），以評(píng)價(jià)各微丸的定位釋藥性能。

2 結(jié)果

2.1 微丸的體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)分布

苦參丸心在給藥后 0.5～2 h 均完全停留于大鼠胃部；給藥后 0.5 h 丸心完整，但明顯溶脹，捏之易碎；給藥后 1 h 丸心仍然完整，溶脹更為明顯，極易碎裂；給藥后 2 h 大部分丸心已破裂，且難以與胃內(nèi)容物分離。3 種靶向微丸給藥后，除在胃部停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（6 h 以上）的少量微丸略有輕微溶脹外，其余時(shí)間點(diǎn)微丸在胃、小腸段內(nèi)外觀均未見明顯變化，能完整地進(jìn)入結(jié)腸；在給藥后 10～12 h結(jié)腸段微丸有明顯溶脹、破碎現(xiàn)象，給藥后 20～24 h 基本破碎完全。

統(tǒng)計(jì)計(jì)算 3 種靶向微丸給藥后不同時(shí)間點(diǎn)在各段消化道的分布率，結(jié)果顯示：①胃部：3 種靶向微丸胃排空均呈連續(xù)性，I 型與 II 型排出 50%約需 4 h，完全排出約需 10～12 h，兩者無(wú)明顯差異；而 III 型微丸排出 50%約需 8 h，明顯慢于 I、II 型。②小腸段：在所有時(shí)間點(diǎn)，I、II 型微丸僅在給藥后 2～4 h，III 型微丸在給藥后 3～8 h 可檢測(cè)到少量微丸分布，分布率最高僅為33.3%，表明微丸在小腸段不會(huì)長(zhǎng)時(shí)間滯留，轉(zhuǎn)運(yùn)較快。③結(jié)腸段：3 種靶向微丸均在給藥后 3～4 h 有少量抵達(dá)結(jié)腸；I、II 型微丸在給藥后 4 h 胃與小腸段的總分布率依次為81.6%、61.6%，而在給藥后 8 h 結(jié)腸段分布率依次為78.3%、91.7%；III 型微丸在給藥后 8 h 胃與小腸段的總分布率仍為67.2%，在給藥后 10 h 結(jié)腸段分布率為83.3%，與 I、II 型微丸相比，抵達(dá)結(jié)腸時(shí)間明顯延遲（表1～3）。

表1 給藥后不同時(shí)間 I 型微丸在大鼠消化道內(nèi)的分布（%，n = 3）Table 1 The distribution of model I pellets in rats alimentary canal after administration at different times (%, n = 3)

表2 給藥后不同時(shí)間 II 型微丸在大鼠消化道內(nèi)的分布（%，n = 3）Table 2 The distribution of model II pellets in rats alimentary canal after administration at different times (%, n = 3)

表3 給藥后不同時(shí)間 III 型微丸在大鼠消化道內(nèi)的分布（%，n = 3）Table 3 The distribution of model III pellets in rats alimentary canal after administration at different times (%, n = 3)

2.2 微丸體內(nèi)累積釋放度

HPLC 法測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)大鼠消化道內(nèi)各微丸中苦參堿、氧化苦參堿的殘留總量，計(jì)算各微丸的累積釋放度，并繪制釋藥曲線，結(jié)果顯示：①苦參丸心在給藥后 0.5 h 累積釋放度達(dá) 91.3%，基本釋藥完全；與苦參丸心相比，3 種靶向微丸均具有明顯的遲釋效應(yīng)。② I、II 型微丸在給藥后 8 h 累積釋放度分別為17.4%、11.8%，III 型微丸在給藥后 10 h 累積釋放度為34.5%，因此時(shí)絕大部分微丸已被轉(zhuǎn)運(yùn)至結(jié)腸，3 種靶向微丸在胃與小腸段累積釋放度由高至低依次為III 型 ＞ I 型 ＞ II 型。③ I、II、III 型微丸在給藥后 24 h 累積釋放度分別為98.9 %、97.7%、91.7%，基本釋藥完全，3 種靶向微丸在結(jié)腸段累積釋放度由高至低依次為I 型 ＞ II 型 ＞ III 型（表4，圖2）。

表4 給藥后不同時(shí)間3種靶向微丸的體內(nèi)累積釋放度（%，n = 3）Table 4 The accumulated drug release rate of three kinds of target pellets in vivo after administration at different times (%, n = 3)

圖2 3 種靶向微丸的體內(nèi)釋藥曲線Figure 2 Drug release curves of three kinds of target pellets in vivo

2.3 微丸體內(nèi)定位釋藥性能

選擇 I、II 型微丸在給藥后 8 h 累積釋放度R胃+小腸值，III 型微丸在給藥 10 h 后累積釋放度R胃+小腸值，3 種靶向微丸在給藥后 24 h 累積釋放度 R結(jié)腸值，分別計(jì)算 I、II、III 型微丸的體內(nèi)定位釋藥指數(shù)（Ind），結(jié)果分別為4.7、7.3、1.7，據(jù)此推斷其結(jié)腸定位釋藥性能由高至低依次為II 型＞ I 型 ＞ III 型。

3 討論

在胃腸道中的轉(zhuǎn)運(yùn)是影響口服結(jié)腸靶向給藥系統(tǒng)（OCTDS）靶向性及藥效的關(guān)鍵因素之一。3 種苦參結(jié)腸靶向微丸在大鼠體內(nèi)的胃排空時(shí)間明顯長(zhǎng)于通常認(rèn)可的 2 h，部分微丸可在胃部停留達(dá) 10 h，這是否由人與大鼠之間種屬差異所致，仍有待深入研究。同時(shí)，在小腸段各時(shí)間點(diǎn)僅檢測(cè)到少量微丸分布，提示其一旦進(jìn)入小腸后，即可被迅速且穩(wěn)定地轉(zhuǎn)運(yùn)至結(jié)腸，不存在異常滯留現(xiàn)象，與當(dāng)前對(duì)小腸轉(zhuǎn)運(yùn)的認(rèn)識(shí)一致。III 型微丸的胃排空速率明顯慢于 I 型、II 型微丸，導(dǎo)致其抵達(dá)結(jié)腸時(shí)間比 I 型、II 型微丸延遲 2 h 左右，這可能是 III 型微丸在胃與小腸累積釋放度偏高、定位釋藥性能偏低的原因之一，提示 OCTDS 制劑的胃排空速率及其抗胃液侵蝕性能是需要重點(diǎn)關(guān)注的因素。

由于受小腸吸收、腸道代謝、檢測(cè)方法等影響，直接測(cè)定各段消化道內(nèi)容物中藥物濃度，以評(píng)價(jià)微丸在體內(nèi)累積釋藥性能可能存在較大誤差。本研究根據(jù)給藥后不同時(shí)間點(diǎn)微丸在各段消化道內(nèi)的分布情況，測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)各段消化道內(nèi)微丸中殘留藥物含量，從而間接計(jì)算累積釋放度，不僅易于檢測(cè)，而且可排除體內(nèi)因素干擾，為判斷微丸在各段消化道的釋放情況提供了較為可靠的依據(jù)，但也存在難以直接判斷微丸在某一具體部位釋藥量的問(wèn)題。此外，3 種靶向微丸的定位釋藥指數(shù)（Ind）均根據(jù)其各自體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、分布情況，選擇與真實(shí)情況最為接近的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算而得，雖然這些數(shù)據(jù)并非微丸在胃、小腸、結(jié)腸釋藥量的真實(shí)數(shù)值，但對(duì)于分析 3 種靶向微丸的結(jié)腸定位釋藥性能仍具有一定指導(dǎo)意義。

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