胃腸道間質(zhì)瘤中Maspin表達(dá)及其與p53表達(dá)的相關(guān)性

李寶江 姜忠敏 張立東 張 亮 鄭 末

胃腸道間質(zhì)瘤(gastrointestinal stromal tumors,GIST)是常見(jiàn)的消化道間葉源性腫瘤，其良、惡性在臨床依然很難準(zhǔn)確界定[1]。目前主要根據(jù)GIST腫瘤體積大小和核分裂像的多少判斷腫瘤惡性行為，然而近來(lái)發(fā)現(xiàn)直徑很小的GIST也可能發(fā)生浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，一旦發(fā)生瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，患者的預(yù)后極差。因此，尋找特異性標(biāo)記物來(lái)準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)腫瘤生物學(xué)行為及患者預(yù)后顯得十分重要。

研究證實(shí)，在多數(shù)腫瘤中maspin蛋白表達(dá)下調(diào)或缺失可促進(jìn)癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，預(yù)示患者預(yù)后不良，因此，被認(rèn)為是1種潛在的抑癌基因[2,3]。目前有關(guān)maspin在GIST中的研究相對(duì)較少，本文通過(guò)檢測(cè)maspin蛋白在GIST中的表達(dá)，分析其與GIST生物學(xué)行為、患者預(yù)后及p53表達(dá)的相關(guān)關(guān)系，以探討maspin基因在GIST發(fā)生、發(fā)展和侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用及其相關(guān)的分子病理學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇2000年1月至2010年3月、天津市第五中心醫(yī)院病理科收集的54例胃腸道間葉源性腫瘤的蠟塊，根據(jù)光鏡下組織形態(tài)學(xué)特點(diǎn)及CD117、CD34、SMA、Desmin及S-100蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果確診為GIST 42例。所有病例均經(jīng)病理醫(yī)生復(fù)查，HE染色進(jìn)行以下幾個(gè)方面特征評(píng)估：組織學(xué)類型、壞死、核分裂像(在 ×400倍下觀察50個(gè)視野)等。

1.2 主要試劑

鼠抗人maspin單克隆抗體和鼠抗人p53單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Nevomarkers公司；Envision試劑盒及氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Dako公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色 采用Envison兩步法：取上述存檔的石蠟組織塊，連續(xù)組織切片，厚4 μm，常規(guī) HE 染色及免疫組織化學(xué)染色。免疫組織化學(xué)染色按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，maspin抗體稀釋度為1∶500，p53抗體稀釋度為1∶200。用已知陽(yáng)性片和 PBS 代替一抗分別作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。

1.3.2 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) Maspin以胞質(zhì)和(或)胞核內(nèi)出現(xiàn)明顯的黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性染色；p53以胞核內(nèi)出現(xiàn)明顯的黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性染色。兩名病理醫(yī)師獨(dú)立觀察，選染色均勻腫瘤區(qū)10個(gè)高倍視野，以陽(yáng)性細(xì)胞率進(jìn)行判斷。陽(yáng)性細(xì)胞率<20%為陰性(-)，20%～40%為弱陽(yáng)性(+)，41%～59%為陽(yáng)性(++)，≥60%為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，采用χ2檢驗(yàn)及spearman等級(jí)相關(guān)分析，對(duì)隨訪資料進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，采用log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行組間生存率比較。

1.5 隨訪及生存分析

對(duì)所有病例進(jìn)行后期隨訪，并進(jìn)行生存狀態(tài)分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料

本組54例，確診GIST 42例。男性23例，女性19例；年齡26～75歲，中位年齡53歲；腫瘤部位：胃21例，小腸13例，大腸6例，胃腸道外2例；組織學(xué)類型：梭形細(xì)胞型25例，上皮樣細(xì)胞型7例，混合細(xì)胞型10例。按Flecher分級(jí)法將42例GIST分為3組：極低和低度侵襲危險(xiǎn)性11例，中度侵襲危險(xiǎn)性19例，高度侵襲危險(xiǎn)性12例。

2.2 maspin蛋白表達(dá)與GIST臨床病理特征的關(guān)系

42例GIST中，maspin陽(yáng)性表達(dá)率為64.3%(26/42)，不同性別、年齡、腫瘤部位和組織學(xué)類型間比較，maspin表達(dá)差異無(wú)顯著性(P>0.05)；在不同侵襲危險(xiǎn)性GIST中maspin表達(dá)有顯著性差異(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.3 maspin與p53蛋白表達(dá)的相關(guān)性

42例GIST中，p53蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為69.0%(29/42)。Maspin表達(dá)與p53表達(dá)的相關(guān)性見(jiàn)表2，經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析，maspin表達(dá)與p53蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性(P<0.01)。

表1 maspin表達(dá)與GIST臨床病理特征的關(guān)系(例，%)

表2 GIST組織中maspin表達(dá)與p53表達(dá)的相關(guān)性

2.4 隨訪結(jié)果

42例GIST患者中28例獲隨訪，隨訪率為66.7%，隨訪時(shí)間為3～98個(gè)月，平均隨訪時(shí)間為32個(gè)月。maspin蛋白表達(dá)與GIST患者生存期呈負(fù)相關(guān)性(P<0.05)，并作出Kaplan-Meier曲線，見(jiàn)圖1。

圖1 Kaplan-Meier生存曲線

3 討論

Maspin基因?qū)儆诮z氨酸蛋白酶抑制劑serpin超家族成員之一，最初由Zou等[4]在1994年用消減雜交技術(shù)對(duì)正常乳腺組織和乳腺癌組織進(jìn)行比較時(shí)發(fā)現(xiàn)。研究表明，maspin蛋白在多數(shù)正常人體器官組織中有不同程度的表達(dá)，而在相應(yīng)的惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)或不表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中，maspin在抑制腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、增殖、腫瘤新生血管生成和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方面都起著重要作用，可以作為腫瘤轉(zhuǎn)移及預(yù)后評(píng)估的一個(gè)重要指標(biāo)[5]。Sood等[6]研究表明，maspin蛋白在卵巢癌中過(guò)度表達(dá)，而且maspin蛋白的過(guò)表達(dá)與較高的腫瘤分級(jí)和總的生存期較短有關(guān)。以往關(guān)于maspin的報(bào)道多為上皮腫瘤，在間質(zhì)腫瘤中的研究報(bào)道較少。Saduman等[7]通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)maspin在GIST中的表達(dá)情況，研究發(fā)現(xiàn)其平均表達(dá)率為66.6%，在高危險(xiǎn)組中的表達(dá)顯著低于中危險(xiǎn)組和低危險(xiǎn)組。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與maspin的腫瘤抑制功能是一致的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)maspin表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤部位、組織學(xué)類型無(wú)顯著相關(guān)；與腫瘤侵襲危險(xiǎn)性呈顯著負(fù)相關(guān)，隨著侵襲危險(xiǎn)性的增加，maspin表達(dá)顯著降低；與患者預(yù)后呈顯著正相關(guān)，其表達(dá)越低，患者的預(yù)后越差。該結(jié)果提示maspin可能是GIST發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)重要抑制因子，該結(jié)果與Saduman的研究結(jié)果基本一致。

p53基因是腫瘤抑癌基因之一，當(dāng)野生型p53突變時(shí)不僅失去了抑制癌變功能，還促使正常細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化。體外研究發(fā)現(xiàn)，maspin表達(dá)受野生型p53的直接調(diào)節(jié)：maspin啟動(dòng)子上游存在p53結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)野生型p53結(jié)合到maspin啟動(dòng)子的p53結(jié)合位點(diǎn)后能刺激組蛋白的乙?；⒃黾訂?dòng)區(qū)染色質(zhì)的可進(jìn)入性，并通過(guò)影響maspin的甲基化抑制屏障而激活maspin的啟動(dòng)子。當(dāng)野生型p53基因突變時(shí)，p53就失去了刺激maspin基因轉(zhuǎn)錄的功能[8,9]。Soog等[10，11]研究了p53與maspin在結(jié)腸、胃癌和前列腺中的表達(dá)相關(guān)性，結(jié)果表明maspin的表達(dá)與野生型p53水平呈正相關(guān)，與突變型p53水平呈負(fù)相關(guān)，提示maspin可能是體內(nèi)p53的作用靶基因。此外，DNA破壞性物質(zhì)和細(xì)胞毒性藥物能誘導(dǎo)野生型p53基因在腫瘤細(xì)胞表達(dá)內(nèi)源性的maspin，但是對(duì)于含有突變型的p53細(xì)胞則沒(méi)有此作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明maspin與突變型p53表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，與maspin在大部分上皮源性腫瘤的表達(dá)規(guī)律基本一致。提示maspin的抑癌功能可能與p53抑癌通路密切相關(guān)；maspin表達(dá)下調(diào)促使GIST演進(jìn)也可能與p53基因突變有關(guān)，具體機(jī)制尚需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，maspin的單獨(dú)檢測(cè)或與p53聯(lián)合應(yīng)用，有望為未來(lái)評(píng)定GIST的生物學(xué)行為及預(yù)測(cè)患者預(yù)后方面，提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] Liegl-Atzwanger B,Fletcher JA,Fletcher CD,et al.Gastrointestinal stromal tumors〔J〕.Virchows Arch,2010,456(2):111.

[2] Stark AM,Schem C,Maass N,et al.Expression of metastasis suppressor gene maspin is reduced in breast cancer brain metastases and correlates with the estrogen receptor status〔J〕.Neurol Res,2010,32(3):303.

[3] Santer FR,Malinowska K,Culig Z,et al.Interleukin-6 tran-s-signalling differentially regulates proliferation,migration,adhesion and maspin expression in human prostate cancer cells〔J〕.Endocr Relat Cancer,2010,17(1):241.

[4] Zou Z，Anisowicz A，Hendrix MJ，et al.Maspin，a serpin with tumor suppression activeity in human mmmnary epithedial cells〔J〕.Sci,1994,63:329.

[5] Tsuji T,Togami S,Douchi T,et al.Difference in subcellular localization of maspin expression in ovarian mucinous borderline tumour〔J〕.Histopathology,2009,55(1):130.

[6] Sood AK，F(xiàn)letcher MS，Gruman LM，et al.The paradoxical expression of maspin in ovarian carcinoma〔J〕.Clin cKncer Res,2002,8:2924.

[7] Saduman Balaban Adim1,Gulaydan Filiz1,Ozkan Kanat,et al.Maspin expression in gastrointestinal stromal tumors〔J〕.World J Surg Oncol,2010,26:8.

[8] 方世蘭,嚴(yán) 倩,張永欣,等.Maspin與p53在宮頸鱗癌中的表達(dá)及相關(guān)性分析〔J〕.中國(guó)婦產(chǎn)科臨床雜志,2009,l0:377.

[9] Boltze C,Schneider-Stock R,Meyer F,et al.Maspin in thyroid cancer:its relationship with p53 and clinical outcome〔J〕.Oncol Rep,2003,10:1783.

[10] Doo-Young Lee，Chang-Sop Park，Hyung-Seok Kim，et al.Maspin and p53 protein expression in gastric adenocarcinoma and its clinical applications〔J〕.Appl Immunohistochem Mol Morphol,2008,16:14.

[11] Vered M,Allon I,Dayan D.Maspin,p53,p63,and Ki-67 in epithelial lesions of the tongue:from hyperplasia through dysplasia to carcinoma〔J〕.J Oral Pathol Med,2009,38(3):314.