環(huán)氧化酶-2 765G/C基因多態(tài)性對原發(fā)性肝癌易感性的研究

宋 霞 程世紅 劉 純 劉亞麗 孫晶晶

肝細胞肝癌(hepatiocellular carcinoma，HCC，以下簡稱肝癌)是世界上也是我國最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年新發(fā)病56.4萬例，且有上升的趨勢[1]。近年來，環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)作為1個非常重要的腫瘤相關基因，得到了廣泛的重視。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)COX-2的基因多態(tài)性(SNP)與食管癌[2]、口腔鱗狀細胞癌[3]、結腸癌[4]、乳腺癌[5]等腫瘤的發(fā)病風險相關，在肝癌組織中也發(fā)現(xiàn)了COX-2的異常表達[6]。本文對COX-2 啟動子區(qū)域的-765 G/C基因多態(tài)性進行分析，旨在探討COX-2 啟動子區(qū)域-765G/C基因多態(tài)性與肝癌發(fā)生易感性的關系。

1 材料與方法

1.1 資料

肝癌組300例，男性204例，女性96例，年齡42～74歲，平均59.13歲。健康對照組300例，男性192例，女性108例，年齡24～78歲，平均45.77歲。肝癌組選自2000年1月～2010年3月蘭州大學第一醫(yī)院普外二科、腫瘤科收治的、經(jīng)過血清學、臨床檢驗、影像學、病理學檢查確診的患者，符合世界衛(wèi)生組織(WHO)關于肝癌的命名和診斷標準。健康對照組選自蘭州大學第一醫(yī)院體檢中心。同地區(qū)、排除病毒性肝炎、腫瘤和消化系統(tǒng)疾病的健康人群。兩組均為甘肅省常住人口(居住超過15年)，應用統(tǒng)一調(diào)查表的形式進行調(diào)查，包括年齡、性別、飲酒史和肝癌家族史，在納入研究前采集流行病學資料，每位患者均被告知研究細則，并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 外周血基因組DNA的提取 清晨空腹采集外周靜脈血4 ml，k2-EDTA抗凝，-80℃凍存?zhèn)溆?。統(tǒng)一采用常規(guī)蛋白酶K、酚/氯仿法抽提外周血基因組DNA。

1.2.2 COX-2基因多態(tài)性檢測 采用多聚酶鏈反應—限制性片段長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)法，對COX-2-765G/C位點基因分型。引物參考文獻[7]設計。上游引物：F 5’ -ATT CTG GCC ATC GCC GCT TC-3’；下游引物： R 5’ -CTC CTT GTT TCT TGG AAA GAG ACG-3’ (由上?；瞪镉邢薰竞铣?。反應體系為50 μl，包括10×PCR buffer 5 μl，Mg2+3 μl，10 mmol/ L dNTPs 5 μl，引物1、2各2 μl，DNA模板1 μl，DNA聚合酶 1 μl，體積不足部分用雙蒸水補足。PCR反應條件：95 ℃ 預變性3 min，95℃ 變性30 s，59℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，循環(huán)35次，最后72 ℃ 延伸10 min。用未加DNA模板的去離子水反應體系作為陰性對照。PCR產(chǎn)物進行Bsh 1236 I 限制性內(nèi)切酶酶切分型(Fermentas公司)，總反應體系20 μl，包括PCR產(chǎn)物10 μl，10×PCR buffer R 2 μl，Bsh 1236 Ⅰ限制性內(nèi)切酶2 μl，其余部分用三蒸水補齊，37℃ 水浴14 h，3% 瓊脂糖凝膠(溴化乙錠染色)，100 V電泳40 min，電泳結束后用紫外反射透射分析儀對凝膠進行觀察，照相。將PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物與DNA片段長度標準物(20 bp)比較以鑒定基因型。

1.3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理，用Hardy-Weinberg 平衡檢驗樣本的群體代表性，用χ2檢驗比較兩組基因型和等位基因頻率差異，以非條件Logistic 回歸計算相對風險度(odds ratio，OR)及其95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)，評價各基因型與肝癌發(fā)病風險的關系，并以年齡、性別、飲酒史和家族史對等位基因頻率進行分層分析。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg 平衡檢驗

COX-2 -765 G/C基因型分布在健康對照組符合Hardy-Weinberg 平衡(P>0.05)，具有群體代表性。

2.2 一般特性

肝癌組患者年齡42～74歲，中位年齡58歲；健康對照組年齡24～78歲，中位年齡51歲。兩組患者年齡、性別構成差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，有飲酒史者肝癌組分布率高于健康對照組(66.3% vs 57.7%,P=0.029)。有肝癌家族史者肝癌組分布率高于健康對照組(16.3% vs 0.87%,P=0.005)，見表1。

表1 肝癌組與健康對照組的臨床特征(例，%)

2.3 COX-2 -765 G /C 多態(tài)性分析

COX-2 -765G/C 有G/G、G/C、和C/C 3種基因型。PCR 擴增產(chǎn)物片段長度為 157 bp，包含 Bsh 1236 I 酶切片段。G/G基因型(野生型) 的擴增產(chǎn)物可被完全切斷，電泳可見134 bp 片段(23 bp 片段在瓊脂糖凝膠中不顯影)；G/C 基因型為雜合子，可見 157 bp 和134 bp 2種片段，C/C 基因型(突變純合子)不能被酶切斷，僅見157 bp 1種片段。基因分型實驗在雙盲狀態(tài)下進行，采用單純隨機抽樣法，對5%的樣品進行重復基因型檢測，獲得一致結果(圖 1) 。

圖1 COX-2 -765G /C 多態(tài)性PCR-RFLP檢測結果

M為Marker;1為PCR-RFLP擴增產(chǎn)物;2為G/G基因型;3為G/C基因型;4為C/C基因型

2.4 COX-2 -765G/C在肝癌組與健康對照組的基因頻率及等位基因頻率分布比較

COX-2-765 G/C多態(tài)性位點3種基因型的分布率及與肝癌的發(fā)病風險關系見表2。與COX-2 -765G/G純合子相比，單獨攜帶COX-2 -765G/C或攜帶COX-2 -765C/C純合子基因型的個體在肝癌組和健康對照組的分布有統(tǒng)計學差異(G/C型：OR=2.119，95%CI：1.366～3.289；C/C型：OR=5.852，95%CI：1.269～26.990)。將COX-2 -765 G/C和C/C基因型合并后與COX-2 -765 G/G基因型進行比較，肝癌組和健康對照組比較有統(tǒng)計學差異(OR=1.311，95%CI：1.511～3.533)?？梢?，攜帶COX-2 -765*C基因型的個體比攜帶COX-2 -765G/G基因型的個體對肝癌更具有易感性，相同環(huán)境條件下，攜帶COX-2 -765*C基因型的個體患肝癌的風險增加。

2.5 COX-2 -765 G/C多態(tài)性與肝癌發(fā)生的相關性

依據(jù)年齡、性別、飲酒史和家族史幾個方面，對兩組COX-2 -765 G/C等位基因頻率進行分層分析(表3)，并將G/C和C/C 2種基因型合并后與G/G基因型進行比較。結果顯示：在年齡、性別的分層分析中，基因型在肝癌組和健康對照組的分布無差異。在飲酒史分層分析中，攜帶COX-2-765*C基因型的個體患原發(fā)性肝癌的風險是攜帶COX-2-765G/G基因型的3.434倍(OR=3.434；95%CI：1.926～6.137)。在有肝癌家族史的人群中，攜帶COX-2-765*C基因型的個體患原發(fā)性肝癌的風險是攜帶COX-2 -765G/G基因型的4.55倍(OR=4.550；95%CI：1.612～12.845)。

表2 COX-2-765 G/C基因型在肝癌組和對照組的分布情況(例，%)

表3 COX-2-765G/C基因型與肝癌發(fā)病風險相關性的分層分析(例)

3 討論

環(huán)氧化合酶(cyclooxygenase,COX)是花生四烯酸合成前列腺素的關鍵限速酶，至少有2種同種異構體，即COX-1和COX-2。COX-1是結構酶，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在大多數(shù)組織細胞中恒長表達。COX-2是誘導酶，在正常生理狀態(tài)下的大多數(shù)組織中幾乎不表達，但是其可以被生長因子、細胞因子、血管作用多肽以及絲分裂素等誘導表達。

研究發(fā)現(xiàn)COX-2基因多態(tài)性與胃癌[2]、乳腺癌[5]、結直腸癌[4]等的易感性相關。在肝癌組織中也發(fā)現(xiàn)了COX-2的異常表達[6]，COX-2在所有的肝癌組織中都表達，并且在高分化的肝癌組織中的表達高于低分化的肝癌組織，提示COX-2可能參與到了肝癌發(fā)生的早期事件中[8]。

本研究首次對COX-2 -765 G/C 基因多態(tài)性與肝癌易感性進行研究。結果表明：COX-2*C基因型的個體在肝癌組明顯高于健康對照組，提示COX-2 -765*C基因型的個體對肝癌更具有易感性，相同環(huán)境條件下，COX-2 -765*C基因型的個體患肝癌的風險增加。同時依據(jù)年齡、性別、飲酒史和家族史對COX-2 -765 G/C等位基因頻率進行分層分析，發(fā)現(xiàn)：有飲酒史或者家族史的COX-2-765*C基因型的個體對肝癌更具有易感性，提示COX-2-765*C基因型可能與飲酒史或者家族史具有協(xié)同的作用。然而，目前我們還不能解釋清楚COX-2-765*C基因型增加肝癌易感性的原因，可能是COX-2-765 G/C影響了COX-2的轉錄活性。COX-2的表達調(diào)控主要是在轉錄水平上，其中啟動子及其活性對于轉錄的調(diào)控具有重要的作用。COX-2的5’端有TATA盒、CAAT增強子結合蛋白反應元件、CER(c AMP responsive element)反應元件、AP-2(activator protein-2)結合位點，以及NF-κB的結合位點[9]。當細胞受到生長因子、脂多糖、癌基因(如ras、KRAS)等的刺激，經(jīng)過一系列信號轉導作用于COX-2 5’端的調(diào)控序列，促進COX-2轉錄，進而誘導COX-2的表達。在腫瘤中，過度的表達COX-2會導致前列腺素(prostaglandin，PG)水平增高，PG可以通過促進腫瘤新生血管生成、抑制腫瘤細胞凋亡、刺激腫瘤細胞生長、增強腫瘤細胞侵襲力等多種機制誘發(fā)腫瘤的形成[8]。

但是，還有研究表明不同腫瘤類型中COX-2的表達不是完全相同的，在一些地域，一些腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中，COX-2的過表達會抑制腫瘤細胞的生長[10]。Sitarz等對荷蘭人群研究發(fā)現(xiàn)與常見胃癌的COX-2過表達明顯不同，早期胃癌中COX-2低表達，并且在早期胃癌、常見胃癌以及殘胃癌中COX-2 -765*C 基因的頻率低于健康對照組[11]。Melchiorre Cervello等發(fā)現(xiàn)COX-2在所有的肝癌組織中都表達，并且在高分化肝癌組織中的表達高于低分化肝癌組織[8]。其可能的原因是等位基因隨著不同種族和地域而不同，或者是與選取的樣本數(shù)量有關。

在全世界范圍內(nèi)，我國屬于肝癌的高發(fā)國家之一。本研究發(fā)現(xiàn)COX-2 -765 G/C的C基因型增加肝癌易感性。然而，本研究僅僅是基于血清DNA水平的粗略研究，還有待于進一步的深入和細化，同時值得注意的是，由于樣本量有限，本研究只能視為初步研究，有關的結論有必要進一步擴大樣本驗證。

[1] Ratain MJ,Insights into the pharmacokinetics and pharmacodynamics of irinotecan〔J〕.Clin Cancer Res,2000,6(9):3393.

[2] Upadhyay RM,Jain S,Kumar UC,et al.Functional polymorphisms of cyclooxygenase-2 (COX-2) gene and risk for esophageal squmaous cell carcinoma〔J〕.Mutat Res,2009,663(1～2):52.

[3] Lin YC,Huang HI,Wang LH,et al.Polymorphisms of COX-2 -765G>C and p53 codon 72 and risks of oral squamous cell carcinoma in a Taiwan population〔J〕.Oral Oncol,2008,44(8):798.

[4] Strillacci AC,Griffoni P,Sansone P,et al.MiR-101 downregulation is involved in cyclooxygenase-2 overexpression in human colon cancer cells〔J〕.Exp Cell Res,2009,315(8):1439.

[5] Li F,Ren GS,Li HY,et al.A novel single nucleotide polymorphism of the cyclooxygenase-2 gene associated with breast cancer〔J〕.Clin Oncol (R Coll Radiol),2009,21(4):302.

[6] Shiota GM,Okubo T,Noumi N,et al.Cyclooxygenase-2 expression in hepatocellular carcinoma〔J〕.Hepatogastroenterology,1999,46(25):407.

[7] Saxena A,Prasad KN,Ghoshal UC,et al.Polymorphism of -765G > C COX-2 is a risk factor for gastric adenocarcinoma and peptic ulcer disease in addition to H pylori infection：a study from northern India〔J〕.World J Gastroenterol,2008,14(10):1498.

[8] Cervello M,Foderaa D,Florena AM,et al.Correlation between expression of cyclooxygenase-2 and the presence of inflammatory cells in human primary hepatocellular carcinoma：possible role in tumor promotion and angiogenesis〔J〕.World J Gastroenterol,2005,11(30):4638.

[9] Appleby SB,Ristimaki A,Neilson K,et al.Structure of the human cyclo-oxygenase-2 gene〔J〕.Biochem J,1994,302 ( Pt 3):723.

[10] Trifan OC,Smith RM,Thompson BD,et al.Overexpression of cyclooxygenase-2 induces cell cycle arrest.Evidence for a prostaglandin-independent mechanism〔J〕.J Biol Chem,1999,274(48):34141.

[11] Sitarz R,Leguit RJ,de Leng WW,et al.The COX-2 promoter polymorphism -765 G>C is associated with early-onset,conventional and stump gastric cancers〔J〕.Mod Pathol,2008,21(6):685.