NF-κB和GM-CSF表達(dá)與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移相關(guān)性的研究

何戰(zhàn)洋 何萍青 應(yīng)學(xué)翔 林燕蘋 王富文

從世界范圍來(lái)看，乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，骨是乳腺癌最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移部位，約65%～70%晚期乳腺癌患者會(huì)出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移[1,2]。骨轉(zhuǎn)移患者會(huì)出現(xiàn)疼痛、病理性骨折、脊髓壓迫等癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。目前尚無(wú)簡(jiǎn)單的方法精準(zhǔn)地預(yù)測(cè)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移是1個(gè)復(fù)雜的、非隨機(jī)的、連續(xù)的多步驟的過(guò)程，需要特定基因的表達(dá)[2]，然而其中的很多基因我們?nèi)匀徊涣私鈁3]。Park采用標(biāo)準(zhǔn)的乳腺癌骨轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞內(nèi)的NF-κB表達(dá)活躍，導(dǎo)致GM-CSF水平升高，從而誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的形成并導(dǎo)致骨質(zhì)破壞[4]，我們就乳腺癌組織中NF-κB、GM-CSF表達(dá)與骨轉(zhuǎn)移發(fā)生的相關(guān)性及其與乳腺癌臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性，進(jìn)行回顧性分析。

1 材料與方法

1.1 材料

選取上海市第六人民醫(yī)院2000年1月～2007年12月間收治的乳腺癌病例，術(shù)前均未行化療、放療、內(nèi)分泌治療，均為乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(非特殊型)，且經(jīng)病理專家復(fù)讀確認(rèn)，骨轉(zhuǎn)移病例均經(jīng)骨掃描和X線或CT等檢查證實(shí)，符合標(biāo)準(zhǔn)的有52例乳腺癌骨轉(zhuǎn)移和72例乳腺癌患者，以52例乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者為實(shí)驗(yàn)組，72例乳腺癌患者為對(duì)照組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)對(duì)比兩組在年齡、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤臨床分期、腫塊大小、淋巴結(jié)狀態(tài)等無(wú)明顯差異，所有患者均為女性,年齡33～76歲，平均年齡53.2歲。病例均獲得2年以上隨訪,隨訪率為100%。按WHO標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各病例進(jìn)行分型和分級(jí)，其中組織學(xué)分級(jí)Ⅰ～Ⅱ級(jí)74例，Ⅲ級(jí)50例，并按照分子病理分型分為4組：luminal A型、luminal B型、HER-2過(guò)表達(dá)型、basal-like型，所有標(biāo)本為病理科石蠟包埋的存檔組織塊，重新制作4μm連續(xù)切片，貼于涂有0.05%多聚賴氨酸的載玻片備用。

1.2 試劑與方法

兔抗人NF-κB p65單克隆抗體為美國(guó)cell signaling公司產(chǎn)品，GM-CSF 抗體購(gòu)自ABCAM 公司,抗體稀釋濃度為1∶50。采用檸檬酸鈉緩沖液熱抗原修復(fù)，S-P免疫組織化學(xué)法，以已知陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判斷

NF-κB陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞核中,GM-CSF陽(yáng)性染色定位于胞質(zhì)和胞膜。染色為黃色或棕褐色顆粒。每例均隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野(×200)。對(duì)每例切片,采用半定量積分法判斷結(jié)果。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%為0分，6%～25%為1分,26%～50%為2分,51%～75%為3分,>75%為4分;陽(yáng)性染色黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。兩者積分相乘,0分為陰性(-),1～4分為弱陽(yáng)性(+),5～8分為中度陽(yáng)性(++),9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS(16.0 for Windows)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用χ2檢驗(yàn)及Spearman相關(guān)分析，以P<0.05判為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NF-κB和GM-CSF表達(dá)與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

52例乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組中36例NF-κB陽(yáng)性，陽(yáng)性率為69.2%，72例對(duì)照組中30例NF-κB陽(yáng)性，陽(yáng)性率為41.7%，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)，見(jiàn)表1。52例乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中GM-CSF陽(yáng)性18例，陽(yáng)性率為34.6%，36例對(duì)照組中GM-CSF陽(yáng)性46例，陽(yáng)性率為63.9%，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。

NF-κB陽(yáng)性表達(dá)66例中GM-CSF表達(dá)陽(yáng)性36例，陽(yáng)性表達(dá)率為54.5%,NF-κB陰性表達(dá)58例中GM-CSF陽(yáng)性表達(dá)28例，陽(yáng)性表達(dá)率為48.3%,Spearman相關(guān)分析兩者無(wú)明顯相關(guān)性(P=0.490)。

2.2 NF-κB和GM-CSF表達(dá)與乳腺癌分子病理分型的關(guān)系

表1 兩組中NF-κB和GM-CSF表達(dá)情況(例，%)

表2 NF-κB和GM-CSF與乳腺癌分子病理分型的關(guān)系(例，%)

由表2 可見(jiàn)，NF-κB與乳腺癌分子病理分型有明顯相關(guān)性，P=0.000；而GM-CSF與乳腺癌分子病理分型無(wú)明顯相關(guān)性，P=0.991。

2.3 NF-κB和GM-CSF表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

由表3可見(jiàn)，NF-κB表達(dá)與腫塊大小有關(guān),3組間有顯著性差異(P<0.05); NF-κB表達(dá)也與腫瘤臨床分期有關(guān)，臨床分期越高NF-κB陽(yáng)性表達(dá)率越高，兩者間有顯著性差異(P<0.05)；NF-κB表達(dá)也與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)有關(guān)，4組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；NF-κB表達(dá)也與ER狀態(tài)有關(guān)，ER陰性組其陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于ER陽(yáng)性組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；NF-κB表達(dá)也與HER-2有關(guān),HER-2陽(yáng)性者NF-κB表達(dá)陽(yáng)性率高于HER-2陰性者,兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。NF-κB表達(dá)與p53有關(guān)，p53陽(yáng)性者NF-κB表達(dá)陽(yáng)性率高于p53陰性者,兩者間差異有顯著性意義(P<0.05)，NF-κB表達(dá)與患者年齡、組織學(xué)分級(jí)、PR狀態(tài)、KI-67等無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)，然而，GM-CSF表達(dá)與乳腺癌臨床病理指標(biāo)均無(wú)明顯相關(guān)性 (P>0.05) 。

表3 NF-κB和GM-CSF表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系(例，%)

3 討論

乳腺癌骨轉(zhuǎn)移以溶骨性骨轉(zhuǎn)移最為常見(jiàn)，其中破骨細(xì)胞起主要作用，破骨細(xì)胞(osteoclast,OC)分化受2個(gè)重要細(xì)胞因子的調(diào)節(jié):單核/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(monocyte/macrophage-clone stim ulating factor,M-CSF)和核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB受體激動(dòng)劑的配體(ligand of recep tor activator of nuclear factor kappaB,RANKL),M-CSF主要維持OC的生長(zhǎng),RANKL則促進(jìn)OC的定向分化[5]。OC是1種終末分化的多核巨細(xì)胞,與單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞系同來(lái)源于骨髓生血前體細(xì)胞[6]。Park醫(yī)生采用標(biāo)準(zhǔn)的乳腺癌骨轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)NF-KB通過(guò)GM-CSF促進(jìn)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生[4]，這一報(bào)道引起很大反響，眾所周知粒細(xì)胞單核細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-monocytecolonystimulatingfactor，GM-CSF)作為惡性腫瘤放化療輔助藥物，可刺激造血前體細(xì)胞的增殖和分化，升高白細(xì)胞數(shù)量。這一結(jié)果來(lái)自動(dòng)物模型，而針對(duì)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者的類似研究報(bào)道很少。

本研究發(fā)現(xiàn)，骨轉(zhuǎn)移組NF-κB陽(yáng)性表達(dá)率高于對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示NF-κB與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移有一定的相關(guān)性，與很多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。研究表明核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子,由p50和p65 2個(gè)亞基組成,通常以同源或異源二聚體的非活性形式存在于幾乎所有細(xì)胞的胞質(zhì)中,只有被激活后,才從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位于細(xì)胞核發(fā)揮重要的作用，活化的NF-κB在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制與它抗凋亡及促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)等有關(guān)[7]，有研究表明NF-κB還可以提高乳腺癌細(xì)胞多藥耐藥基因的表達(dá),使乳腺癌細(xì)胞內(nèi)化療藥物濃度下降而產(chǎn)生抗藥性，而有利于乳腺癌轉(zhuǎn)移[8]。

GM-CSF實(shí)驗(yàn)組陽(yáng)性表達(dá)率低于對(duì)照組，且兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但NF-KB與GM-CSF表達(dá)間無(wú)明顯相關(guān)性，也從另一方面提示臨床用粒細(xì)胞單核細(xì)胞集落刺激因子升高白細(xì)胞數(shù)量作為惡性腫瘤放化療輔助藥物，有一定的安全性?？赡芘cGM-CSF存在多態(tài)性和多種受體有關(guān)，研究證實(shí)GM-CSF至少以3種形式存在于體內(nèi)，即可溶性(S-M-CSF)、膜結(jié)合型(m-M-CSF)和基質(zhì)結(jié)合或糖蛋白型(PG-M-CSF)，吳克復(fù)等[9]研究表明：①M(fèi)-CSF 及其受體呈明顯的多態(tài)性，但是都可被同一單抗識(shí)別；②不同部位，不同大小的GM-CSF 及其受體的功能不盡相同； ③病理狀態(tài)下出現(xiàn)膜結(jié)合型的 M-CSF 和可溶性的受體以及與基質(zhì)結(jié)合的蛋白糖，即 M-CSF 及其受體呈多樣性，與國(guó)外同行報(bào)道的一致。也可能因?yàn)镚M-CSF與骨轉(zhuǎn)移存在劑量效應(yīng)關(guān)系，Yao等[10]研究發(fā)現(xiàn)M-CSF能夠誘導(dǎo)fos基因的轉(zhuǎn)錄,c-fos缺失小鼠不能形成成熟的破骨細(xì)胞。M-CSF還可調(diào)節(jié)骨保護(hù)素(OPG)mRNA表達(dá)和OPG蛋白分泌,從而影響破骨細(xì)胞的活性,這種調(diào)節(jié)方式具有劑量依賴性,并且在一定條件下是可逆的[11]。相似的研究還有Angela等[12]用小鼠模型研究GM-CSF增強(qiáng)破骨細(xì)胞的形成存在劑量效應(yīng)現(xiàn)象，當(dāng)GM-CSF的劑量范圍從10～15 ng/ml會(huì)導(dǎo)致酸性磷酸酶的增加，而且當(dāng)GM-CSF 50 ng/ml和骨髓巨細(xì)胞加入到破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨破壞模型中，可發(fā)現(xiàn)鈣磷酸鹽吸收比基礎(chǔ)水平明顯增加。然而與此相反的是許多臨床隨機(jī)臨床試驗(yàn)用GM-CSF支持化療，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)副作用及促進(jìn)骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生，事實(shí)上乳腺癌患者用GM-CSF支持劑量密集化療相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)化療不加用GM-CSF增高了患者的無(wú)病生存率[13,14]。

Kadri Altundag研究表明，GM-CSF可誘導(dǎo)血管的形成增加絕經(jīng)前淋巴結(jié)陽(yáng)性的乳腺癌患者術(shù)后對(duì)化療的敏感性，而并沒(méi)有增加骨轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[15]。Udagawa研究表明，GM-CSF可抑制小鼠破骨細(xì)胞的形成從而抑制骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生[16]。骨轉(zhuǎn)移還存在其他的相關(guān)機(jī)制，本研究并不能證明GM-CSF與骨轉(zhuǎn)移的直接相關(guān)性，NF-κB、GM-CSF與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制尚需要大量的研究證實(shí)。

本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)NF-κB與很多臨床病理指標(biāo)有相關(guān)性(臨床分期、淋巴結(jié)狀態(tài)、HER-2狀態(tài)、ER狀態(tài)等)，Sovak等[17]在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)NF-κB在乳腺癌中高表達(dá),并且隨臨床分期增高、轉(zhuǎn)移發(fā)生愈早,其表達(dá)越顯著,這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。本研究還發(fā)現(xiàn)ER陰性、HER-2陽(yáng)性的乳腺癌患者中NF-κB陽(yáng)性表達(dá)率越高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與很多研究結(jié)果相一致，Harikrishna等[18]研究ER陰性乳腺癌轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)的分子學(xué)機(jī)制過(guò)程中,證實(shí)并提出了NF-κB在ER陰性乳腺癌細(xì)胞中的高水平表達(dá),且這種表達(dá)是由于部分功能性ER缺乏的結(jié)果,并證實(shí)了這種高表達(dá)尤其是在組織分化差且伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中表達(dá)更為顯著。有很多的研究結(jié)果支持NF-κB在乳腺癌中的抗凋亡作用,而且這種作用與乳腺癌ER和原癌基因HER-2的表達(dá)狀態(tài)相關(guān)[19,20]陰性、HER -2陽(yáng)性的人乳腺癌細(xì)胞系中,免疫熒光法顯示p65的核表達(dá)率為86%,HER-2過(guò)表達(dá)時(shí)的抗凋亡通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB的活性并誘導(dǎo)Bcl-2的表達(dá)[21]，但Patricia等[22]提出了不同見(jiàn)解,ER狀態(tài)與NF-κB的活化水平在乳腺癌中并無(wú)明顯相關(guān)性。體外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)人類表皮生長(zhǎng)因子受體家族的2個(gè)重要成員EGFR和HER-2可以活化PI3K-AKT激酶途徑使轉(zhuǎn)錄加快，且活化的Akt/NF-KB抗凋亡級(jí)聯(lián)效應(yīng)使癌細(xì)胞能抵抗凋亡，降低機(jī)體抗腫瘤的能力[23,24]。

本研究結(jié)果提示，NF-κB蛋白質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)，且有高轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)如臨床分期晚、腋窩淋巴結(jié)已發(fā)生轉(zhuǎn)移、ER陰性表達(dá)、HER-2陽(yáng)性表達(dá)的乳腺癌患者，應(yīng)加強(qiáng)術(shù)后隨訪，密切追蹤，一般宜在6個(gè)月左右行骨顯像，對(duì)有骨局部癥狀和(或)骨顯像見(jiàn)可疑病灶者應(yīng)在更短時(shí)間內(nèi)復(fù)查。對(duì)骨轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較小的乳腺癌患者術(shù)后亦應(yīng)常規(guī)定期行骨顯像。

針對(duì)乳腺癌患者腫塊內(nèi)NF-κB、GM-CSF 2個(gè)指標(biāo)與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的相關(guān)性的回顧性研究很少，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法(尤其半定量分析)，主觀因素，界值標(biāo)準(zhǔn)、樣本量大小、隨訪時(shí)間長(zhǎng)短、腋窩淋巴結(jié)隱匿轉(zhuǎn)移灶的存在、以及部分生物學(xué)標(biāo)記因子在癌組織中表達(dá)不均一性等均在一定程度上影響結(jié)果分析，骨放射性核素掃描仍將在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[25]，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,對(duì)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的細(xì)胞分子水平的機(jī)制會(huì)有更進(jìn)一步的了解,從而可以進(jìn)一步找到新的藥物標(biāo)靶,開(kāi)發(fā)出相應(yīng)的治療藥物,給乳腺癌及其骨轉(zhuǎn)移的治療帶來(lái)更廣闊的前景。也許在不久的將來(lái)這些基因能精準(zhǔn)預(yù)測(cè)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生，甚至成為乳腺癌骨轉(zhuǎn)移治療的靶點(diǎn)。

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