NF-κB和GM-CSF表達與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移相關性的研究

何戰(zhàn)洋 何萍青 應學翔 林燕蘋 王富文

從世界范圍來看，乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，骨是乳腺癌最常見的轉(zhuǎn)移部位，約65%～70%晚期乳腺癌患者會出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移[1,2]。骨轉(zhuǎn)移患者會出現(xiàn)疼痛、病理性骨折、脊髓壓迫等癥狀，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。目前尚無簡單的方法精準地預測乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移是1個復雜的、非隨機的、連續(xù)的多步驟的過程，需要特定基因的表達[2]，然而其中的很多基因我們?nèi)匀徊涣私鈁3]。Park采用標準的乳腺癌骨轉(zhuǎn)移動物模型，發(fā)現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移的乳腺癌細胞內(nèi)的NF-κB表達活躍，導致GM-CSF水平升高，從而誘導破骨細胞的形成并導致骨質(zhì)破壞[4]，我們就乳腺癌組織中NF-κB、GM-CSF表達與骨轉(zhuǎn)移發(fā)生的相關性及其與乳腺癌臨床病理指標的相關性，進行回顧性分析。

1 材料與方法

1.1 材料

選取上海市第六人民醫(yī)院2000年1月～2007年12月間收治的乳腺癌病例，術前均未行化療、放療、內(nèi)分泌治療，均為乳腺浸潤性導管癌(非特殊型)，且經(jīng)病理專家復讀確認，骨轉(zhuǎn)移病例均經(jīng)骨掃描和X線或CT等檢查證實，符合標準的有52例乳腺癌骨轉(zhuǎn)移和72例乳腺癌患者，以52例乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者為實驗組，72例乳腺癌患者為對照組，經(jīng)統(tǒng)計學對比兩組在年齡、組織學分級、腫瘤臨床分期、腫塊大小、淋巴結狀態(tài)等無明顯差異，所有患者均為女性,年齡33～76歲，平均年齡53.2歲。病例均獲得2年以上隨訪,隨訪率為100%。按WHO標準對各病例進行分型和分級，其中組織學分級Ⅰ～Ⅱ級74例，Ⅲ級50例，并按照分子病理分型分為4組：luminal A型、luminal B型、HER-2過表達型、basal-like型，所有標本為病理科石蠟包埋的存檔組織塊，重新制作4μm連續(xù)切片，貼于涂有0.05%多聚賴氨酸的載玻片備用。

1.2 試劑與方法

兔抗人NF-κB p65單克隆抗體為美國cell signaling公司產(chǎn)品，GM-CSF 抗體購自ABCAM 公司,抗體稀釋濃度為1∶50。采用檸檬酸鈉緩沖液熱抗原修復，S-P免疫組織化學法，以已知陽性片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結果判斷

NF-κB陽性染色定位于細胞核中,GM-CSF陽性染色定位于胞質(zhì)和胞膜。染色為黃色或棕褐色顆粒。每例均隨機觀察5個高倍視野(×200)。對每例切片,采用半定量積分法判斷結果。陽性細胞數(shù)<5%為0分，6%～25%為1分,26%～50%為2分,51%～75%為3分,>75%為4分;陽性染色黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。兩者積分相乘,0分為陰性(-),1～4分為弱陽性(+),5～8分為中度陽性(++),9～12分為強陽性(+++)。

1.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS(16.0 for Windows)軟件進行統(tǒng)計學處理。采用χ2檢驗及Spearman相關分析，以P<0.05判為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NF-κB和GM-CSF表達與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的相關性

52例乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組中36例NF-κB陽性，陽性率為69.2%，72例對照組中30例NF-κB陽性，陽性率為41.7%，2組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.002)，見表1。52例乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中GM-CSF陽性18例，陽性率為34.6%，36例對照組中GM-CSF陽性46例，陽性率為63.9%，2組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.001)。

NF-κB陽性表達66例中GM-CSF表達陽性36例，陽性表達率為54.5%,NF-κB陰性表達58例中GM-CSF陽性表達28例，陽性表達率為48.3%,Spearman相關分析兩者無明顯相關性(P=0.490)。

2.2 NF-κB和GM-CSF表達與乳腺癌分子病理分型的關系

表1 兩組中NF-κB和GM-CSF表達情況(例，%)

表2 NF-κB和GM-CSF與乳腺癌分子病理分型的關系(例，%)

由表2 可見，NF-κB與乳腺癌分子病理分型有明顯相關性，P=0.000；而GM-CSF與乳腺癌分子病理分型無明顯相關性，P=0.991。

2.3 NF-κB和GM-CSF表達與乳腺癌臨床病理特征的關系

由表3可見，NF-κB表達與腫塊大小有關,3組間有顯著性差異(P<0.05); NF-κB表達也與腫瘤臨床分期有關，臨床分期越高NF-κB陽性表達率越高，兩者間有顯著性差異(P<0.05)；NF-κB表達也與淋巴結轉(zhuǎn)移個數(shù)有關，4組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；NF-κB表達也與ER狀態(tài)有關，ER陰性組其陽性表達率明顯高于ER陽性組，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；NF-κB表達也與HER-2有關,HER-2陽性者NF-κB表達陽性率高于HER-2陰性者,兩者間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。NF-κB表達與p53有關，p53陽性者NF-κB表達陽性率高于p53陰性者,兩者間差異有顯著性意義(P<0.05)，NF-κB表達與患者年齡、組織學分級、PR狀態(tài)、KI-67等無明顯相關性(P>0.05)，然而，GM-CSF表達與乳腺癌臨床病理指標均無明顯相關性 (P>0.05) 。

表3 NF-κB和GM-CSF表達與乳腺癌臨床病理特征的關系(例，%)

3 討論

乳腺癌骨轉(zhuǎn)移以溶骨性骨轉(zhuǎn)移最為常見，其中破骨細胞起主要作用，破骨細胞(osteoclast,OC)分化受2個重要細胞因子的調(diào)節(jié):單核/巨噬細胞集落刺激因子(monocyte/macrophage-clone stim ulating factor,M-CSF)和核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB受體激動劑的配體(ligand of recep tor activator of nuclear factor kappaB,RANKL),M-CSF主要維持OC的生長,RANKL則促進OC的定向分化[5]。OC是1種終末分化的多核巨細胞,與單核細胞或巨噬細胞系同來源于骨髓生血前體細胞[6]。Park醫(yī)生采用標準的乳腺癌骨轉(zhuǎn)移動物模型，發(fā)現(xiàn)NF-KB通過GM-CSF促進乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生[4]，這一報道引起很大反響，眾所周知粒細胞單核細胞集落刺激因子(granulocyte-monocytecolonystimulatingfactor，GM-CSF)作為惡性腫瘤放化療輔助藥物，可刺激造血前體細胞的增殖和分化，升高白細胞數(shù)量。這一結果來自動物模型，而針對乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者的類似研究報道很少。

本研究發(fā)現(xiàn)，骨轉(zhuǎn)移組NF-κB陽性表達率高于對照組，且差異有統(tǒng)計學意義，提示NF-κB與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移有一定的相關性，與很多動物實驗結果相一致。研究表明核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子,由p50和p65 2個亞基組成,通常以同源或異源二聚體的非活性形式存在于幾乎所有細胞的胞質(zhì)中,只有被激活后,才從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位于細胞核發(fā)揮重要的作用，活化的NF-κB在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機制與它抗凋亡及促進細胞生長等有關[7]，有研究表明NF-κB還可以提高乳腺癌細胞多藥耐藥基因的表達,使乳腺癌細胞內(nèi)化療藥物濃度下降而產(chǎn)生抗藥性，而有利于乳腺癌轉(zhuǎn)移[8]。

GM-CSF實驗組陽性表達率低于對照組，且兩組差異有統(tǒng)計學意義，但NF-KB與GM-CSF表達間無明顯相關性，也從另一方面提示臨床用粒細胞單核細胞集落刺激因子升高白細胞數(shù)量作為惡性腫瘤放化療輔助藥物，有一定的安全性?？赡芘cGM-CSF存在多態(tài)性和多種受體有關，研究證實GM-CSF至少以3種形式存在于體內(nèi)，即可溶性(S-M-CSF)、膜結合型(m-M-CSF)和基質(zhì)結合或糖蛋白型(PG-M-CSF)，吳克復等[9]研究表明：①M-CSF 及其受體呈明顯的多態(tài)性，但是都可被同一單抗識別；②不同部位，不同大小的GM-CSF 及其受體的功能不盡相同； ③病理狀態(tài)下出現(xiàn)膜結合型的 M-CSF 和可溶性的受體以及與基質(zhì)結合的蛋白糖，即 M-CSF 及其受體呈多樣性，與國外同行報道的一致。也可能因為GM-CSF與骨轉(zhuǎn)移存在劑量效應關系，Yao等[10]研究發(fā)現(xiàn)M-CSF能夠誘導fos基因的轉(zhuǎn)錄,c-fos缺失小鼠不能形成成熟的破骨細胞。M-CSF還可調(diào)節(jié)骨保護素(OPG)mRNA表達和OPG蛋白分泌,從而影響破骨細胞的活性,這種調(diào)節(jié)方式具有劑量依賴性,并且在一定條件下是可逆的[11]。相似的研究還有Angela等[12]用小鼠模型研究GM-CSF增強破骨細胞的形成存在劑量效應現(xiàn)象，當GM-CSF的劑量范圍從10～15 ng/ml會導致酸性磷酸酶的增加，而且當GM-CSF 50 ng/ml和骨髓巨細胞加入到破骨細胞介導的骨破壞模型中，可發(fā)現(xiàn)鈣磷酸鹽吸收比基礎水平明顯增加。然而與此相反的是許多臨床隨機臨床試驗用GM-CSF支持化療，并沒有發(fā)現(xiàn)副作用及促進骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生，事實上乳腺癌患者用GM-CSF支持劑量密集化療相對于標準化療不加用GM-CSF增高了患者的無病生存率[13,14]。

Kadri Altundag研究表明，GM-CSF可誘導血管的形成增加絕經(jīng)前淋巴結陽性的乳腺癌患者術后對化療的敏感性，而并沒有增加骨轉(zhuǎn)移的風險[15]。Udagawa研究表明，GM-CSF可抑制小鼠破骨細胞的形成從而抑制骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生[16]。骨轉(zhuǎn)移還存在其他的相關機制，本研究并不能證明GM-CSF與骨轉(zhuǎn)移的直接相關性，NF-κB、GM-CSF與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的相關機制尚需要大量的研究證實。

本實驗也發(fā)現(xiàn)NF-κB與很多臨床病理指標有相關性(臨床分期、淋巴結狀態(tài)、HER-2狀態(tài)、ER狀態(tài)等)，Sovak等[17]在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)NF-κB在乳腺癌中高表達,并且隨臨床分期增高、轉(zhuǎn)移發(fā)生愈早,其表達越顯著,這與我們的實驗結果相一致。本研究還發(fā)現(xiàn)ER陰性、HER-2陽性的乳腺癌患者中NF-κB陽性表達率越高，且差異有統(tǒng)計學意義，這與很多研究結果相一致，Harikrishna等[18]研究ER陰性乳腺癌轉(zhuǎn)移生長的分子學機制過程中,證實并提出了NF-κB在ER陰性乳腺癌細胞中的高水平表達,且這種表達是由于部分功能性ER缺乏的結果,并證實了這種高表達尤其是在組織分化差且伴有淋巴結轉(zhuǎn)移的浸潤性導管癌中表達更為顯著。有很多的研究結果支持NF-κB在乳腺癌中的抗凋亡作用,而且這種作用與乳腺癌ER和原癌基因HER-2的表達狀態(tài)相關[19,20]陰性、HER -2陽性的人乳腺癌細胞系中,免疫熒光法顯示p65的核表達率為86%,HER-2過表達時的抗凋亡通過調(diào)節(jié)NF-κB的活性并誘導Bcl-2的表達[21]，但Patricia等[22]提出了不同見解,ER狀態(tài)與NF-κB的活化水平在乳腺癌中并無明顯相關性。體外實驗已證實人類表皮生長因子受體家族的2個重要成員EGFR和HER-2可以活化PI3K-AKT激酶途徑使轉(zhuǎn)錄加快，且活化的Akt/NF-KB抗凋亡級聯(lián)效應使癌細胞能抵抗凋亡，降低機體抗腫瘤的能力[23,24]。

本研究結果提示，NF-κB蛋白質(zhì)陽性表達，且有高轉(zhuǎn)移風險如臨床分期晚、腋窩淋巴結已發(fā)生轉(zhuǎn)移、ER陰性表達、HER-2陽性表達的乳腺癌患者，應加強術后隨訪，密切追蹤，一般宜在6個月左右行骨顯像，對有骨局部癥狀和(或)骨顯像見可疑病灶者應在更短時間內(nèi)復查。對骨轉(zhuǎn)移風險相對較小的乳腺癌患者術后亦應常規(guī)定期行骨顯像。

針對乳腺癌患者腫塊內(nèi)NF-κB、GM-CSF 2個指標與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的相關性的回顧性研究很少，本實驗應用免疫組織化學方法(尤其半定量分析)，主觀因素，界值標準、樣本量大小、隨訪時間長短、腋窩淋巴結隱匿轉(zhuǎn)移灶的存在、以及部分生物學標記因子在癌組織中表達不均一性等均在一定程度上影響結果分析，骨放射性核素掃描仍將在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[25]，隨著分子生物學技術的進步,對乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的細胞分子水平的機制會有更進一步的了解,從而可以進一步找到新的藥物標靶,開發(fā)出相應的治療藥物,給乳腺癌及其骨轉(zhuǎn)移的治療帶來更廣闊的前景。也許在不久的將來這些基因能精準預測乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生，甚至成為乳腺癌骨轉(zhuǎn)移治療的靶點。

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