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    淺藍(lán)菌素聯(lián)合表阿霉素對人骨肉瘤細(xì)胞U2-OS增殖的抑制作用

    2011-06-07 07:34:14鄒平安劉志禮羅慶豐
    實(shí)用癌癥雜志 2011年3期
    關(guān)鍵詞:實(shí)驗

    鄒平安 劉志禮 羅慶豐 王 高 周 揚(yáng) 舒 勇

    骨肉瘤是1種常見于青少年的原發(fā)性惡性骨腫瘤,在0~14歲的青少年中和0~19歲青少年中的發(fā)病率分別為每年3.5~4.6/百萬人和每年4.6~5.6/百萬人[1],化療是其主要的治療手段之一。表阿霉素是骨肉瘤化療的常見藥物之一,但臨床證實(shí)骨肉瘤細(xì)胞對表阿霉素易產(chǎn)生耐藥性。淺藍(lán)菌素能在體內(nèi)、外誘導(dǎo)人多種惡性腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制增殖[2,3]。本實(shí)驗旨在探討淺藍(lán)菌素是否能增強(qiáng)表阿霉素骨肉瘤細(xì)胞U2-OS的抑制作用,為骨肉瘤協(xié)同用藥提供實(shí)驗基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    骨肉瘤細(xì)胞株U2-OS購自北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)生物細(xì)胞庫;F12型培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司;胎牛血清購自杭州四季青生物工程有限公司;胰蛋白酶凍干粉(含EDTA)購自美國Sigma公司;表阿霉素購自浙江海正藥業(yè)公司,溶于滅菌去離子水中制備成10 mg/ml的母液,培養(yǎng)基稀釋成工作濃度,4℃儲存;DMSO、MTT、淺藍(lán)菌素(Cerulenin)購自美國Sigma公司,溶于二甲基亞砜(DMSO)中制備成50 mg/ml的母液,培養(yǎng)基稀釋成工作濃度(用培養(yǎng)基稀釋后工作液DMSO濃度<1%),-20℃儲存。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) U2-OS細(xì)胞貼壁生長于含10%胎牛血清的F12型培養(yǎng)液中,其中青霉素、鏈霉素各100 U/ml,于37℃、5%CO2的飽和濕度孵育箱中培養(yǎng)。做細(xì)胞生長曲線,對數(shù)生長期處于細(xì)胞傳代后第3~5天,取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗。

    1.2.2 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗 調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×104/ml接種于無菌96孔培養(yǎng)板,每孔100 μl,繼續(xù)培養(yǎng)12 h,待細(xì)胞貼壁后,表阿霉素單獨(dú)作用組分別給予含表阿霉素濃度分別為1 μg/ml,2.5 μg/ml,5 μg/ml,10 μg/ml,25 μg/ml的培養(yǎng)液200 μl;淺藍(lán)菌素單獨(dú)作用組分別給予含淺藍(lán)菌素濃度分別為1 μg/ml,5 μg/ml,10 μg/ml,20 μg/ml,50 μg/ml的培養(yǎng)液200 μl。同時設(shè)立DMSO的陰性對照組、F12培養(yǎng)基空白對照組。每組每個濃度下設(shè)5個復(fù)孔,培養(yǎng)24 h后,每孔加入20 μl的MTT(5 mg/mL),孵育4 h后,棄上清,加入DMSO,終止反應(yīng)。微振蕩5 min后,于酶標(biāo)儀波長490 nm處測吸光度(A)。以上各組實(shí)驗重復(fù)3次。抑制率(%)=(1-實(shí)驗組A值/對照組A值)×100%。用細(xì)胞存活率對劑量對數(shù)作圖并按作圖法求出IC50值。選取2種藥物最小濃度以及2種藥物最接近IC50且小于IC50的濃度做聯(lián)合實(shí)驗。(即選用1 μg/ml表阿霉素+1 μg/ml淺藍(lán)菌素以及10 μg/ml表阿霉素+20 μg/ml淺藍(lán)菌素做聯(lián)合實(shí)驗)。采用Q值判斷淺藍(lán)菌素和表阿霉素聯(lián)合用藥的性質(zhì)。Q=Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb)。公式中Ea代表單藥A的抑制率,Eb代表單藥B的抑制率,Ea+b代表兩藥聯(lián)用的抑制率。Q 值>1.15為兩藥協(xié)同作用,0.85≤Q≤1.15為相加作用,Q<0.85為拮抗作用。

    2 結(jié)果

    U2-OS細(xì)胞經(jīng)不同濃度表阿霉素、淺藍(lán)菌素單獨(dú)處理24 h后,細(xì)胞生長程度受到不同程度的抑制,且抑制程度依賴于藥物劑量的增加,其IC50分別為10.83 μg/ml和26.88 μg/ml(圖1、2)。各實(shí)驗組與對照組抑制率比較差異有顯著性(P<0.05)。在聯(lián)合組中,U2-OS細(xì)胞經(jīng)聯(lián)合藥物處理24 h后,細(xì)胞的抑制率明顯增高;表阿霉素與淺藍(lán)菌素聯(lián)合濃度(1μg/ml+1 μg/ml)組為兩藥協(xié)同作用;(10 μg/ml+20 μg/ml)組為兩藥相加作用見表1。

    圖1 MTT檢測表阿霉素對U2-OS細(xì)胞增殖的抑制率

    圖2 MTT檢測淺藍(lán)菌素對U2-OS細(xì)胞增殖的抑制率

    表1 MTT檢測聯(lián)合藥物對U2-OS細(xì)胞增殖抑制情況(n=3)

    3 討論

    表阿霉素為蒽環(huán)類藥物,與阿霉素的區(qū)別只是在氨基糖部分4’位的羥基由順式變成反式。由于表阿霉素毒副作用更低,所以臨床上將表阿霉素作為骨肉瘤化療的常用藥物。表阿霉素對細(xì)胞周期各階段均有作用,為細(xì)胞周期非特異性藥物。但是對乳腺癌的研究發(fā)現(xiàn),阿霉素也能夠激活NF-KB的活性而抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡,影響其抗腫瘤效果[4]。

    淺藍(lán)菌素是藍(lán)色頭孢霉的自然代謝產(chǎn)物,化學(xué)名為(2R,3S)-2,3-環(huán)氧-4,酮-7,10-反,反12碳二烯酸酰胺。淺藍(lán)菌素可以特異性地以環(huán)氧部位與脂肪酸合酶(fatty acid synthase,F(xiàn)AS)中的β-酮酰基合成酶的活性部位半胱氨酸巰基形成共價結(jié)合,抑制FAS活性,其可能的信號通路是通過抑制線粒體途徑[5]和抑制NF-KB的表達(dá)及活性而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[6]。

    本實(shí)驗結(jié)果證實(shí)U2-OS細(xì)胞經(jīng)不同濃度表阿霉素、淺藍(lán)菌素處理24 h后,細(xì)胞生長程度受到不同程度的抑制,且抑制程度依賴于藥物劑量的增加。聯(lián)合用藥后,細(xì)胞抑制率明顯增高,Q值分別為1.24(1 μg/ml表阿霉素+1 μg/ml淺藍(lán)菌素)和0.96(10 μg/ml表阿霉素濃度+20 μg/ml淺藍(lán)菌素)。

    本實(shí)驗只證實(shí)淺藍(lán)菌素能增強(qiáng)表阿霉素對人骨肉瘤細(xì)胞(U2-OS)抑制作用,但其機(jī)制是否與抑制NF-KB的表達(dá)及活性有關(guān)仍需進(jìn)一步研究。

    [1] Ottaviani G,Jaffe N.The epidemiology of osteosarcoma〔J〕.Cancer Treat Res,2009,152:3.

    [2] Silva SD,Perez DE,Nishimoto IN,et al.Fatty acid synthase expression in quamous cell carcinoma of the tongue:clinicopathological findings〔J〕.Oral Dis,2008,14(4):376.

    [3] Walter K,Hong SM,Nyhan S,et al.Serum fatty acid synthase as a marker of pancreatic neoplasia〔J〕.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2009,18(9):2380.

    [4] Das KC,White CW.Activation of NF—kappa B by antineoplastic agents.Role of protein kinase C〔J〕.J Biol Chem,1997,272:14914.

    [5] 黃 偉,舒 勇,黃山虎,等.淺藍(lán)菌素在誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞株U2-OS凋亡過程中對 Bcl-2和Bax的影響〔J〕.江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2009,49(3):22.

    [6] 黃培林,金月玲,朱世能,等.NF-kb在脂肪酸合成酶制劑誘導(dǎo)人結(jié)腸癌lovo 細(xì)胞凋亡中的作用〔J〕.腫瘤防治研究,2010,28(4):296.

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