非培養(yǎng)技術(shù)解析生化系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)

崔 迪，李 昂，王繼華，張 斯，龐長瀧，馬 放，王 立，崔 瀟

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，150090 哈爾濱，jscz－dd@hotmail.com;2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)市政環(huán)境工程學(xué)院，150090 哈爾濱;3.哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，150025 哈爾濱)

非培養(yǎng)技術(shù)解析生化系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)

崔 迪1，2，李 昂1，2，王繼華3，張 斯1，2，龐長瀧1，2，馬 放1，2，王 立1，2，崔 瀟1，2

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，150090 哈爾濱，jscz－dd@hotmail.com;2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)市政環(huán)境工程學(xué)院，150090 哈爾濱;3.哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，150025 哈爾濱)

為揭示城市污水廠生化系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行階段微生物與污染物降解效率間的關(guān)系，采用變性梯度凝膠電泳(PCR－DGGE)和Biolog技術(shù)，對(duì)冬春季城市污水廠穩(wěn)定運(yùn)行階段生化系統(tǒng)中的微生物群落結(jié)構(gòu)及代謝活性進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測.結(jié)果顯示，冬春季生化系統(tǒng)出水水質(zhì)指標(biāo)COD、NH4+－N和TN的平均去除率分別達(dá)84.4%、84.7%和59.8%左右.同季生化系統(tǒng)中不同位點(diǎn)微生物群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，以芽孢桿菌 (Bacillus)、假單胞菌(Pseudomonas)、氣單胞菌(Aeromonas)為主的優(yōu)勢菌群生態(tài)位穩(wěn)定;春季溫度升高，生化系統(tǒng)中微生物種群數(shù)量、多樣性及代謝活性均加強(qiáng)，利于污染物的有效去除.

生化系統(tǒng);微生物群落;變性梯度凝膠電泳;Biolog;代謝活性

活性污泥法因其投資少、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于城市污水處理廠，但由于生化處理系統(tǒng)主體是微生物而存在一定的不可預(yù)測和不可控性［1－5］，因此，城市污水處理廠穩(wěn)定運(yùn)行期生化系統(tǒng)內(nèi)部微生物的生存狀態(tài)是亟待解決的主要問題之一.傳統(tǒng)的生物學(xué)研究方法已經(jīng)無法滿足對(duì)微生物進(jìn)行實(shí)時(shí)跟蹤監(jiān)測的要求，而微生物非培養(yǎng)技術(shù)［6］的應(yīng)用可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的不足.其中變性梯度凝膠電泳 (Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)與Biolog兩種技術(shù)近年來已廣泛應(yīng)用于土壤、水體污染［7－9］等環(huán)境領(lǐng)域微生物空間變化的研究中.

本文主要采用PCR－DGGE技術(shù)，跟蹤監(jiān)測某城市污水處理廠生化系統(tǒng)中微生物季節(jié)性的演替規(guī)律，同時(shí)應(yīng)用簡便、快速的 Biolog技術(shù)［10－12］考察生化系統(tǒng)中微生物對(duì)不同碳源的代謝活性及多樣性.對(duì)兩種方法在揭示城市污水廠生化系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行階段微生物與污染物降解效率間關(guān)系的可行性進(jìn)行深入探討，為研究低溫生境生化系統(tǒng)中高效降解微生物間的關(guān)系提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐.

1 試驗(yàn)

1.1 工藝概述

針對(duì)北方地區(qū)特有的低溫生態(tài)條件，處理工藝為A/O活性污泥法［13］，設(shè)計(jì)進(jìn)出水水質(zhì)見表1，出水執(zhí)行《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB18918—2002)二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［14］.

表1 污水廠設(shè)計(jì)進(jìn)出水水質(zhì) mg·L－1

1.2 樣品采集及DNA提取

分別于冬季11月和春季4月采集生化系統(tǒng)前段及末段活性污泥樣品，各150～200 mL，離心收集，保存于－80℃.

微生物DNA的提取采用試劑盒(上海華舜生物技術(shù)有限公司)方法，吸光度OD260/OD280比值均在1.62～1.72，所得基因組DNA片斷較為完整，純度較好，滿足后續(xù)PCR擴(kuò)增模板要求.

1.3 PCR－DGGE及聚類分析

PCR 反應(yīng)體系(50 μL):100 ng模板、20 pmol GC338F 和 518R 引物［15］各 0.5 μL、200 μmol/L dNTPs(每種 10 mmol/L)4 μL、10 × PCR buffer(MgCl2)5 μL、2.5 U 的 Pfu DNA 聚合酶1 μL，無菌純水補(bǔ)齊到50 μL.

PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55 ℃ 退火 40 s，72 ℃ 延伸 40 s，30 個(gè)循環(huán)，72℃最終延伸8 min.PCR產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

采用Bio－Rad公司DcodeTM的基因突變檢測系統(tǒng)對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離.使用梯度混合裝置，制備6% ～12%的聚丙烯酰胺凝膠，變性劑濃度從30%到60%(100%的變性劑為7 mol/L的尿素和40%的去離子甲酰胺的混合物).

電泳條件:溫度設(shè)定為60℃，150 V的電壓下，電泳時(shí)間6 h，獲得凝膠銀染后，經(jīng) Image ScannerⅢ掃描儀掃描.圖譜聚類分析采用UPGAMA算法.

1.4 Biolog活性分析

1.4.1 Biolog Eco板接種液制備［16］

1)將采集的活性污泥樣品沉淀30 min后，取1 mL污泥到1.5 mL離心管中;

2)10 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加1 mL生理鹽水，在振蕩器上振動(dòng)5 min混勻，于10 000 r/min離心1 min以去除大的顆粒物質(zhì);

3)取上清液倒入裝有無菌生理鹽水 (NaCl，0.85%)的試管中，OD590取定值;

4)將上述稀釋液加入 Biolog生態(tài)微孔板(Biolog Eco－ Plate，美國 Biolog公司)(150 μL/孔)中，避光保濕培養(yǎng)，每隔一定時(shí)間用細(xì)菌自動(dòng)讀數(shù)儀在590 nm下讀取數(shù)據(jù)，連續(xù)測定至孔板內(nèi)吸光度無明顯變化為止［17］.

1.4.2 微生物群落多樣性分析

由于采用不同培養(yǎng)時(shí)間的數(shù)據(jù)計(jì)算會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)果，對(duì)各生物相的平均吸光度值與時(shí)間變化曲線相關(guān)聯(lián)進(jìn)行分析，采用培養(yǎng)60 h的數(shù)據(jù)計(jì)算微生物群落的多樣性指數(shù)［18－20］.

1)微生物代謝強(qiáng)度采用平均吸光度，計(jì)算公式為

式中:AC為反應(yīng)孔的吸光度值;AR為對(duì)照孔的吸光度值.

2)微生物群落多樣性采用Shannon指數(shù)H表示，即

式中:Pi=ni/N，其中ni為峰面積，N為所有峰的總面積.

2 結(jié)果分析

2.1 冬春季生化系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行期水質(zhì)指標(biāo)

如圖1(a)、(b)和(c)所示，城市污水處理廠生化處理系統(tǒng)冬春季運(yùn)行水溫維持在11～18℃，進(jìn)水COD、NH4+－N及TN指標(biāo)相對(duì)穩(wěn)定.出水COD去除率平均達(dá)84.4%，NH4+－N去除率平均達(dá)84.7%，TN平均去除率達(dá)59.8%.冬季，生化系統(tǒng)對(duì)NH4+－N的去除效率隨水溫下降而降低;春季，生化系統(tǒng)對(duì)NH4+－N的去除效率隨水溫升高而上升.春季生化系統(tǒng)能夠保持對(duì)NH+4－N轉(zhuǎn)化效率是由于部分硝化及亞硝化細(xì)菌能夠適應(yīng)水體溫度而發(fā)生硝化反應(yīng);冬季水溫的降低使得生化系統(tǒng)中部分硝化及亞硝化細(xì)菌無法適應(yīng)低溫條件而減少了硝化反應(yīng)的發(fā)生，致使NH+4－N去除效率降低［25］.圖1(b)顯示水溫維持在12～13℃階段，生化系統(tǒng)保持較高的NH4+－N轉(zhuǎn)化率，驗(yàn)證了部分可轉(zhuǎn)化N元素的耐冷菌群發(fā)揮脫氮作用，維持了低溫生化系統(tǒng)的穩(wěn)定運(yùn)行.

圖1 冬春季生化系統(tǒng)出水水質(zhì)特征(2007.11—2008.4)

2.2 冬春季生化系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)變化及聚類分析

2.2.1 冬春兩季生化系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)演替

由圖2可見，Lane1，Lane3分別有29和24條帶;Lane2，Lane4分別有38和39條帶.特征優(yōu)勢條帶一直存在系統(tǒng)中，代表生化系統(tǒng)中常駐優(yōu)勢菌群的存在，經(jīng)測序鑒定主要為芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬 (Pseudomonas)、氣單胞菌屬(Aeromonas)等，其中芽孢桿菌作為主要絮凝菌群對(duì)提高生化系統(tǒng)活性污泥的沉降性能起到積極作用［21］;部分菌群優(yōu)勢信號(hào)隨外界溫度的變化而逐漸加強(qiáng)或減弱，如生絲微菌屬(Hyphomicrobiaceae)，其轉(zhuǎn)化 N元素的能力對(duì)生化系統(tǒng)提升脫氮效率具有積極作用［22］，可能為圖1(b)低溫(12～13℃)時(shí)期生化系統(tǒng)保持較高NH4+－N轉(zhuǎn)化率的適低溫功能微生物群落之一.

Lane1，Lane2 和 Lane3，Lane4 分別代表不同季節(jié)生化系統(tǒng)相同位點(diǎn)微生物群落結(jié)構(gòu)，春季溫度升高利于生化系統(tǒng)中微生物的生長，部分適中溫微生物開始富集生長，少量適冷微生物(如Band A，Band B所代表的微生物群落)逐漸消失.

Lane1，Lane3 和 Lane2，Lane4 分別代表相同季節(jié)生化系統(tǒng)不同位點(diǎn)微生物群落結(jié)構(gòu)，溫度不變，各位點(diǎn)的微生物群落結(jié)構(gòu)維持穩(wěn)定，種群數(shù)量改變較小，這是維持生化系統(tǒng)出水水質(zhì)達(dá)標(biāo)的原因之一［21，23］.

圖2 冬春季總細(xì)菌DGGE圖譜

2.2.2 冬春兩季生化系統(tǒng)微生物群落聚類分析

圖3顯示相同季節(jié)各生化系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)的相似性高于不同季節(jié)的微生物群落結(jié)構(gòu)相似性，微生物群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出穩(wěn)定演替的趨勢.Lane1與Lane3相似性達(dá)72%以上;Lane1與Lane2相似性達(dá)65%，相似性發(fā)生變化而降解效率穩(wěn)定，可能是由于部分適低溫微生物在春季被中溫微生物替代或缺失，如部分硝化細(xì)菌及亞硝化細(xì)菌在低溫(＜10℃)生境中無法存活［25］，而生化系統(tǒng)中大部分具有高效降解能力的微生物其功能并沒有隨數(shù)量變化而改變.整體來講，春季微生物種群數(shù)量好于冬季，同時(shí)穩(wěn)定的群落結(jié)構(gòu)保證了群落的功能穩(wěn)定，從而保持生化系統(tǒng)污染物的有效去除.

圖3 DGGE圖譜UPMGA聚類分析

2.3 微生物群落代謝強(qiáng)度及多樣性分析

2.3.1 微生物群落代謝強(qiáng)度變化分析

Biolog公司生產(chǎn)的Eco－PlateTM是按照微生物對(duì)3大營養(yǎng)物質(zhì)糖類、脂類、氨基酸類及其相應(yīng)衍生物劃分原則設(shè)計(jì)出的31種碳源，AWCD指數(shù)反映了微生物菌群對(duì)31種碳源總體的利用程度［24］.根據(jù)AWCD結(jié)果生成的曲線圖符合微生物生長曲線規(guī)律(如圖4所示)，含有潛伏期、指數(shù)期及穩(wěn)定期，但衰亡期因監(jiān)測時(shí)間較短而無法體現(xiàn)［20］.

圖4 平均吸光度隨時(shí)間的變化

兩組曲線擬合度較好，顯示出生化系統(tǒng)不同位點(diǎn)的微生物群落在相同季節(jié)對(duì)所有碳源的利用程度相似;穩(wěn)定期曲線持續(xù)時(shí)間較長，說明冬春季生化系統(tǒng)中微生物能夠較好適應(yīng)生境變化，維持穩(wěn)定的代謝活性，這與圖2生化系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定相符合.同時(shí)，春季生化系統(tǒng)中部分中溫微生物群落隨著溫度的回升而呈倍數(shù)增殖［25］，強(qiáng)化了生化系統(tǒng)原有微生物代謝活性的強(qiáng)度，因此，春季生化系統(tǒng)對(duì)碳源的利用程度高于冬季.

2.3.2 微生物群落多樣性分析

冬春季生化系統(tǒng)中Shannon多樣性指數(shù) (圖5)變化幅度維持在0.118～0.203，微生物多樣性好且物種豐富;而不同季節(jié)微生物群落多樣性有差別，春季好于冬季，這是由于溫度回升使得中溫微生物恢復(fù)倍數(shù)增殖導(dǎo)致生化系統(tǒng)中的微生物在數(shù)量、活性及多樣性上都發(fā)生了改變，這與圖2所顯示的微生物群落演替規(guī)律相一致.

圖5 不同季節(jié)微生物群落Shannon多樣性指數(shù)

3 結(jié)論

1)冬春季大部分能夠高效去除COD、轉(zhuǎn)化NH4+－N及去除TN的微生物可穩(wěn)定作用于生化系統(tǒng)，使得冬春季出水COD平均去除率維持在84.4%左右，NH4+－N平均轉(zhuǎn)化率維持在84.7%左右，TN平均去除率維持在59.8%左右，出水水質(zhì)符合《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB18918—2002)二級(jí)標(biāo)準(zhǔn).

2)以芽孢桿菌、假單胞菌、氣單胞菌為優(yōu)勢菌群的生化系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不同季節(jié)微生物群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律明顯，春季微生物多樣性及代謝活性高于冬季.

3)通過PCR－DGGE及Biolog兩種方法驗(yàn)證了冬春季生化系統(tǒng)出水COD、NH4+－N及TN的去除率與轉(zhuǎn)化率主要受微生物多樣性及代謝活性的影響，兩種方法結(jié)合監(jiān)測低溫城市污水廠生化系統(tǒng)中微生物動(dòng)態(tài)變化是可行的.

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Analysis of microbial community structure of biochemical system using uncultured technology

CUI Di1，2，LI Ang1，2，WANG Ji-hua3，ZHANG Si1，2，PANG Chang-long1，2，MA Fang1，2，WANG Li1，2，CUI Xiao1，2

(1.State Key Lab of Urban Water Resource and Environment，150090 Harbin，China，jscz－dd@hotmail.com;2.School of Municipal and Environmental Engineering，Harbin Institute of Technology，150090 Harbin，China;3.School of Life Science and Technology，Harbin Normal University，150025 Harbin，China)

To reveal the relationship between microorganism and pollutants’degradation in the stability system of the municipal wastewater treatment plant，the dynamic monitoring of microbial community structure and metabolic activity of the stable operation biological system in biological wastewater treatment plant was carried out using the denaturing gradient gel electrophoresis(PCR －DGGE)and Biolog Technology.The results showed that the average removal efficiency of effluent COD，NH4+－N and TN was more than 84.4%，84.7%and 59.8%，respectively.The microbial community structure was stable in the different sites of biological system in the same season，and the ecological niche of predominant functional species including Bacillus，Pseudomonas，Aeromonas was stable.As the temperature increased in spring，the quantity and diversity of population increased significantly.Meanwhile，metabolic activity strengthened in bioloical system，which could improve the removal rates of pollutants.It is feasible to use the two methods to monitor the changes of microbial community structure of biological system in a wastewater treatment plant at low temperature.

biological system;microbial community;PCR－DGGE;Biolog;metabolic activity

X703.1

A

0367－6234(2011)10－0045－05

2010－05－15.

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(51108120，51178139，51108145，50809020);國家水體污染控制與治理科技重大專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(2008ZX07313－001);中國博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20090460901);哈爾濱市科技局青年科技創(chuàng)新人才研究專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(2011RFQXS093).

崔 迪(1984—)，女，博士研究生;

馬 放(1963—)，男，教授，博士生導(dǎo)師.

(編輯 劉 彤)