免疫親和柱凈化-高效液相色譜法測定大米、玉米、辣椒中的橘霉素

許艷麗，鮑 蕾，吳振興，呂 寧，趙 峰，梁成珠

免疫親和柱凈化-高效液相色譜法測定大米、玉米、辣椒中的橘霉素

許艷麗，鮑 蕾，吳振興，呂 寧，趙 峰，梁成珠

(山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，山東 青島 266001)

建立免疫親和柱凈化-高效液相色譜法測定農(nóng)產(chǎn)品中橘霉素的方法。試樣經(jīng)甲醇-水提取，稀釋、過濾后通過含有橘霉素特異性抗體的免疫親和柱凈化，洗脫液用C18色譜柱、乙腈-三氟乙酸溶液(60:40，V/V)分離，熒光檢測器測定(激發(fā)波長331nm，發(fā)射波長500nm)，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明：色譜峰面積與橘霉素含量之間有良好的線性關(guān)系，方法的檢出限為10μg/kg，定量限為30μg/kg，加標(biāo)回收率為61%～96.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3. 72%～6.40%。該方法操作簡便、準(zhǔn)確，回收率高、精密度良好、重現(xiàn)性好，可用于大米、玉米、辣椒中橘霉素的測定。

橘霉素；農(nóng)產(chǎn)品；免疫親和柱凈化；高效液相色譜

橘霉素是由青霉屬和曲霉屬的某些菌株產(chǎn)生的真菌毒素，經(jīng)常出現(xiàn)于面粉、大米、玉米和飼料當(dāng)中[1]。橘霉素可溶于有機(jī)溶劑。紅曲霉可產(chǎn)生色素、抑菌素多種次級代謝產(chǎn)物, 能夠降低膽固醇、降血壓、降血糖，為人類造福，但是紅曲色素的提取采用有機(jī)溶劑提取，故采用目前工藝得到的紅曲色素可能含有橘霉素；橘霉素的存在也會污染紅曲色素及紅曲產(chǎn)品，如酶、醬、紅曲米、功能性紅曲、紅曲米粉、紅曲紅色素(粉狀、液態(tài))、紅曲黃色素(粉狀)、釀酒用曲、紅曲類保健食品等；實驗證明紅曲霉菌產(chǎn)橘霉素是普遍性的問題，橘霉素是紅曲霉固有的次級代謝產(chǎn)物，這是菌種本身特性(基因)所決定的[2]。近年來的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，在許多農(nóng)產(chǎn)品如玉米、大米、奶酪、蘋果、梨和果汁等食品和農(nóng)產(chǎn)品中都有可能檢測到橘霉素和分離到產(chǎn)橘霉素的菌株，不同的菌株之間產(chǎn)毒能力和產(chǎn)毒條件差異很大，為預(yù)防和控制帶來了困難。因此，橘霉素引起的污染問題越來越受到人們的關(guān)注。

日本厚生省在2000年版的“日本食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)”中率先制訂出紅曲色素中橘霉素國家限量標(biāo)準(zhǔn)0.2mg/kg[3]，這一劑量是當(dāng)時能夠檢出的橘霉素的最低劑量，德國等西方國家也都制定了針對我國出口的紅曲相關(guān)產(chǎn)品的新標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定橘霉素的含量必須低于規(guī)定值，否則嚴(yán)禁進(jìn)口銷售，韓國規(guī)定限量為50μg/kg，考慮到歐美對我國產(chǎn)品的要求，我國新的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中確定限量為50μg/kg。但目前在我國，還沒有建立其他農(nóng)產(chǎn)品如大米、玉米和辣椒中橘霉素含量測定的國標(biāo)方法及限量標(biāo)準(zhǔn)。

目前，國內(nèi)外對橘霉素的檢測方法主要有比色法、色譜法、酶聯(lián)免疫分析等方法[4-10]。比色法的樣品回收率低，靈敏度較差；薄層層析法的靈敏度低且重現(xiàn)性差，所以多用于橘霉素的定性檢測；酶聯(lián)免疫分析的方法檢測橘霉素靈敏度高，但抗體制備復(fù)雜、費(fèi)用較高不適合批量檢測，干擾因素較多，重現(xiàn)性差。而且目前現(xiàn)有的檢測方法多用于紅曲及紅曲制品中橘霉素的檢測，對于其他農(nóng)產(chǎn)品中橘霉素的檢測很少有報道[11-18]。本實驗擬采用免疫親和柱凈化-高效液相色譜法，建立大米、玉米、辣椒中橘霉素的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

橘霉素標(biāo)準(zhǔn)品 美國Alexis公司；橘霉素免疫親和柱 美國Vicam公司；甲醇、乙腈(均為色譜純)；三氟乙酸 Sigma公司；標(biāo)準(zhǔn)儲備液：將1mg橘霉素粉末以甲醇溶解并定溶至10.0mL作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液；2mol/L Toledo NaOH溶液：稱取80.0g固體NaOH，溶于1000mL水中；三氟乙酸溶液：1000mL超純水中加入0.5mL三氟乙酸，用2mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH2.5；稀釋液：用2mol/L的NaOH溶液將三氟乙酸水溶液調(diào)節(jié)pH7.5。

1200高效液相色譜儀(配熒光檢測器) 美國Agilent公司：PM480稱量天平 瑞士Mettler Toledo公司；Ultra-turrax T-25高速均質(zhì)器 美國IKA公司；Maxi mixⅡ混勻器 美國Thermolyne公司；純水系統(tǒng) 美國Millipore公司；玻璃纖維濾紙 美國Vicam公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品提取

稱取粉碎樣品(2mm)10.0g(精確至0.1g)于500mL具塞錐形瓶中，加入50mL甲醇-水(70:30，V/V)提取液，以均質(zhì)器高速攪拌提取2min，過濾。移取1.0mL上步的濾液，置于另一干凈的容器中，加入49mL稀釋液稀釋、混勻。以玻纖濾紙過濾幾次，直至濾液澄清，隨即進(jìn)行免疫親和柱凈化。

1.2.2 免疫親和柱凈化

將免疫親和柱連接于10mL玻璃針筒下，準(zhǔn)確移取10.0mL(相當(dāng)于0.04g試樣)上述澄清濾液過免疫親和柱，以1～2滴/s的流速全部通過親和柱，再使2～3mL空氣流經(jīng)親和柱；加入5mL稀釋液以1～2滴/s的流速淋洗柱子，棄去全部流出液；準(zhǔn)確加入1.0mL洗脫液進(jìn)行洗脫，洗脫流速為1～2滴/s。收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(150mm×4.6mm， 5μm)；流動相：乙腈-三氟乙酸水溶液(60:40，V/V)；流速：1.0mL/min；激發(fā)波長331nm，發(fā)射波長500nm；進(jìn)樣量：100μL。

1.2.4 色譜測定

用橘霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液分別配制5個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在1.2.3節(jié)色譜條件下測定，進(jìn)樣量為100μL，以響應(yīng)度為縱坐標(biāo)、出峰時間為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以保留時間定性、外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 不同流動相對色譜圖的影響

圖1 不同流動相條件下的橘霉素色譜圖Fig.1 Chromatograms of citrinin using different mobile phase composition (various mixture of water and acetonitrile or methanol)

本實驗比較了甲醇和乙腈作為流動相對橘霉素色譜峰形的影響(圖1)。從圖1可以看出，以甲醇作為流動相時，保留時間為4.107min，橘霉素峰拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重且峰形不好；乙腈作為流動相時，橘霉素保留時間為3.423min，峰形良好，陳蘊(yùn)等[18]在測定紅曲樣品中的橘霉素時用甲醇溶液作為流動相，也發(fā)現(xiàn)橘霉素峰的拖尾現(xiàn)象較嚴(yán)重，并且與雜質(zhì)無法分離，會造成橘霉素保留時間不穩(wěn)定，故選擇乙腈為流動相。

2.1.2 流動相不同比例對色譜圖的影響

圖2 不同流動相配比條件下的橘霉素色譜圖Fig.2 Chromatograms of citrinin using mixed acetonitrile and TFA aqueous solution at various ratios as a mobile phase

采用乙腈-三氟乙酸水溶液作為流動相，分別考察了乙腈-三氟乙酸水溶液3種不同比例對色譜圖的影響(圖2)。

由圖2可以看出，隨著乙腈比例的降低，橘霉素的保留時間逐漸延后，當(dāng)乙腈體積分?jǐn)?shù)60%時，出峰時間為3.2min，當(dāng)乙腈體積分?jǐn)?shù)降為45%時，出峰時間為6.2min，但是色譜圖拖尾且峰形不好，所以本實驗選取乙腈-三氟乙酸溶液體積配比為60:40。

2.1.3 不同流速對分離效果的影響

本實驗在流動相比例為60:40的條件下設(shè)計了幾個不同的流速(圖3)。

圖3 不同流速對橘霉素峰形的影響Fig.3 Effect of flow rate on peak shape of citrinin during separation

由圖3可以看出，隨著流速的降低，橘霉素的保留時間也在逐漸延后，但是橘霉素的峰拖尾現(xiàn)象也比較嚴(yán)重；當(dāng)流速為1mL/min時，橘霉素的保留時間為3.2min，色譜峰形很好。

圖4 添加橘霉素的辣椒粉色譜圖Fig.4 Chromatogram of pepper powder spiked with citrinin standard

辣椒中色素含量比較高，在提取過程中色素雜質(zhì)易與目標(biāo)物質(zhì)結(jié)合，使分離效果差，由圖4可以看出，流動相比例為60:40、流速為1mL/min時，樣品中的橘霉素峰與雜質(zhì)峰可以有效分離，不會影響樣品中橘霉素的檢測。

2.2 方法可靠性評價

2.2.1 線性范圍

按上述色譜測定方式，配制62.5、125、250、500、 1000μg/kg的標(biāo)準(zhǔn)溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在1.2.3節(jié)色譜條件下測定，結(jié)果相關(guān)系數(shù)為0.99992，在62.5～1000μg/kg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.2.2 方法檢出限和檢測限

經(jīng)測定信噪比(RSN)確定，方法的檢出限為10μg/kg (RSN≥3)，見圖5；方法的定量限為30μg/kg(RSN≥10)，見圖6。本方法能夠滿足國際中的限量要求。

圖5 橘霉素檢出限液相色譜圖(10μg/kg)Fig.5 Chromatogram of citrinin at the detection limit level (10μg/kg)

圖6 橘霉素定量限液相色譜圖(30μg/kg)Fig.6 Chromatogram of citrinin at a concentration of 30μg/kg

表1 精密度實驗結(jié)果Table 1 Results of precision experiments

2.2.3 方法回收率

以空白樣品(大米粉、玉米粉、辣椒粉)為基底，添加3個水平(30、50、80μg/kg)，按1.2節(jié)操作，每水平進(jìn)行10次平行實驗，結(jié)果顯示大米粉不同添加水平的回收率在66.0%～96.5%之間；玉米粉不同添加水平的回收率范圍在61.0%～96.6%之間；辣椒粉不同添加水平的回收率范圍在62.3%～91.9%之間。

2.2.4 方法的精密度

在空白樣品(玉米粉)中添加橘霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加3個水平為 30、50、80μg/kg，每水平進(jìn)行10次平行實驗，結(jié)果如表1所示。

3 結(jié) 論

本研究建立了免疫親和柱凈化-高效液相色譜法檢測農(nóng)產(chǎn)品中橘霉素的方法。免疫親和柱凈化，能夠快速、特異地將橘霉素從樣品中分離出來，凈化程序簡單、凈化率高，適合玉米、大米、辣椒等農(nóng)產(chǎn)品中橘霉素的檢測。方法的定量限為30μg/kg，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差3.72%～6.40%。該方法特異性高、簡便快速、靈敏準(zhǔn)確、可重復(fù)性好、應(yīng)用范圍廣，滿足出入境檢驗工作的要求。方法采用先進(jìn)的生物技術(shù)，而不使用有毒的有機(jī)溶劑如氯仿、二氯甲烷等，所以對操作人員的安全更有保障。

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Determination of Citrinin in Agricultural Products by Immunoaffinity Column Clean-up Coupled with HPLC

XU Yan-li，BAO Lei，WU Zhen-xing，LU Ning，ZHAO Feng，LIANG Cheng-zhu
(Technical Center of Inspection and Quarantine, Shandong Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Qingdao 266001, China)

A HPLC coupled with immunoaffinity column cleanup method for the determination of citrinin in agricultural products such as rice, corn and pepper was established. Samples were extracted with methanol aqueous solution and cleaned up on a column containing anti-citrinin specific antibody. The chromatographic separation was performed on a C18column (150 mm × 4.6 mm, 5μm) eluted by a mobile phase composed of acetonitrile and TFA solution at a ratio of 60:40 (V/V). A fluorescence detector with 331 nm excitation wavelength and 500 nm emission wavelength was used for the quantification of citrinin in an external standard mode. Peak area and citrinin concentration displayed an excellent linear relationship. The limit of detection of this method was 10μg/kg and limit of quantitation was 30μg/kg. The spike recovery rates for citrinin were between 61% and 96.6%, with relative standard deviations ranging from 3.72% to 6.40%. This method has the characteristics of ease of operation, accuracy, high recovery, excellent precision and good reproducibility and is suitable for the determination of citrinin in rice, corn and pepper.

citrinin；agricultural products；immunoaffinity column cleanup；high performance liquid chromatography (HPLC)

TS207.3

A

1002-6630(2011)04-0159-04

2010-03-10

國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗檢疫總局項目(2009IK167)

許艷麗(1981—)，女，工程師，碩士，主要從事真菌毒素及其檢測研究。E-mail：evillive1124@163.com