小鼠骨髓抑制模型的建立

許晶晶，劉奐弟，朱依純

(1.鄭州大學第一附屬醫(yī)院病理科，河南鄭州 450052;2.復旦大學上海醫(yī)學院生理與病理生理學系，上海 200032)

骨髓抑制是臨床上常見的造血系統(tǒng)疾病，它的誘發(fā)因素很多，包括各系統(tǒng)腫瘤性疾病的放射治療或化學治療;電離輻射引起的放射損傷;病毒性肝炎、艾滋病病毒［1－3］等感染因素;藥物［4］(如氯霉素、苯、磺胺、抗癲癇藥、鎮(zhèn)靜劑、抗甲狀腺藥、抗糖尿病藥、抗瘧疾、安眠藥等等)。骨髓抑制可引起骨髓微環(huán)境、造血干細胞、造血細胞生長因子等的損傷，骨髓抑制引起的粒細胞缺乏會導致嚴重感染，紅細胞明顯減少會引起嚴重貧血，血小板明顯下降可以導致嚴重出血，甚至導致死亡［3－4］。建立骨髓抑制動物模型對臨床病人骨髓抑制的病理情況進行模擬，既而研究促進動物模型中骨髓抑制恢復的藥物的作用和影響，這一系列都對臨床治療骨髓抑制起著重大的指導作用，有現實的應用意義。

1 材料與方法

1.1主要儀器及試劑儀器:GK06-100 6MV直線加速器;symmex KX-21全自動血液分析系統(tǒng);精密電子天平;TS-1型脫色搖床;微量移液器;DHG系列電熱恒溫鼓風干燥箱;pH測量儀;倒置相差顯微鏡。

試劑:卡鉑注射液購自齊魯制藥有限公司;EDTA-2Na，肝素鈉注射液，水合氯醛，伊紅，氨水，無水乙醇，二甲苯，石炭酸，低熔點石蠟，多聚甲醛均由校試劑科提供。

1.2動物模型的建立8～10周的♀ BALB/c小鼠，購自上海西普爾－斯必凱動物中心。體質量約20～22 g。每只小鼠腹腔注射1 mg的卡鉑注射液后立即行6 MV直線加速器照射，照射劑量為每只2 Gy，從而產生骨髓抑制。滅菌飲食喂養(yǎng)4周。

1.3觀察的指標及檢測方法

1.3.1血常規(guī)檢測分別于 d 2、d 7、d 14、d 21、d 28 從每個實驗組取出相應數量的小鼠，麻醉后摘除眼球采集外周血，用sysmex KX-21全自動血液分析系統(tǒng)對小鼠外周血進行血細胞、血紅蛋白及血小板計數。

1.3.2骨髓涂片分別于 d 2、d 7、d 14、d 21、d 28 從每個實驗組取出相應數量的小鼠，麻醉后取下肢股骨。利用針管將骨髓吹出骨管，由于骨髓液的纖維蛋白原含量較高，易于凝固，快速推片并迅速使之干燥。然后行HE染色，光鏡下觀察。

1.3.3HE染色

1.3.3.1脫蠟 二甲苯Ⅰ5 min，二甲苯Ⅱ5 min，體積分數為0.95的乙醇Ⅰ 4 min，體積分數為0.95乙醇Ⅱ 2 min，自來水洗片刻，蒸餾水洗片刻。

1.3.3.2染色 蘇木精浸染3 min，自來水沖洗片刻，體積分數為0.01的鹽酸乙醇分色3～5 s，自來水沖洗數分鐘，體積分數為0.5的氨水返藍1～2 min，自來水沖洗10 min，體積分數為0.5的伊紅乙醇浸染2 min。

1.3.3.3脫水 體積分數為0.95的乙醇Ⅰ 2 min，體積分數為0.95的乙醇Ⅱ2 min，無水乙醇Ⅰ2 min，Ⅱ2 min。

1.3.3.4透明 二甲苯 －石炭酸混合液2 min，二甲苯Ⅰ 2 min，二甲苯Ⅱ2 min，二甲苯Ⅲ2 min。

1.3.3.5中性樹膠封固。

1.3.3.6顯微鏡觀察組織病理改變。

1.4統(tǒng)計學方法用SPSS 17.0軟件分析數據，實驗數據用±s表示。兩組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1骨髓細胞懸液顏色的改變放化療結合抑制骨髓后2 d和7 d，骨髓抑制組動物的體重明顯減輕，精神萎靡，毛色失去光澤，骨質脆性增加，骨髓竇出血嚴重，骨髓細胞懸液呈較為明顯的紅色，與未進行骨髓抑制的動物相比有明顯差異(Fig 1)。

2.2觀察動物骨髓涂片放化療結合抑制骨髓7 d后，骨髓抑制組動物的骨髓涂片，與未行骨髓抑制操作的動物相比有明顯差異(Fig 2)，未行卡鉑和放療的動物骨髓涂片增生活躍，各系細胞比例正常(A)。行放化療結合抑制骨髓的動物，骨髓涂片顯示骨髓破壞嚴重，骨髓實質細胞大量減少(B)。

2.3外周血血細胞計數的變化給予卡鉑和放療聯合處理后，發(fā)現動物有潛在出血傾向，外周血各系細胞下降明顯(Fig 3)，紅細胞計數(A)、血紅蛋白含量(B)、血小板計數(D)均在卡鉑和放療聯合處理后14 d達到最低點，此后慢慢恢復，處理后28 d可基本恢復至正常水平。相比紅細胞計數和血紅蛋白含量，血小板計數恢復較為緩慢。外周血白細胞計數(C)在卡鉑和放療聯合處理后7 d達到最低點，此后慢慢恢復，至處理后28 d可基本恢復到正常水平。

3 討論

骨髓抑制的發(fā)生在臨床具有廣泛性和危害性，建立骨髓抑制動物模型、對臨床病人骨髓抑制的病理情況進行模擬、既而研究促進動物模型中骨髓抑制恢復的藥物作用和影響，這一系列都對臨床治療骨髓抑制起著重大的指導作用，有現實的應用意義。

目前建立骨髓抑制模型多采用放療［5］和(或)化療［6－8］誘導，由于化療和輻射所導致的骨髓抑制機制的不同［9］，對各系血細胞的損傷程度亦不相同。用射線復制的骨髓抑制模型，實驗動物多表現為體重下降，解剖發(fā)現各個臟器蒼白，胸腺、脾臟、淋巴結萎縮，脾指數下降，紅細胞、白細胞、血小板及骨髓中粒系、紅系、巨核系、混合系造血祖細胞的數量均有所下降，CD34陽性細胞在骨髓有核細胞中比例下降，非造血細胞增多［10－12］。但是通過射線輻射復制的骨髓模型，其劑量難以控制，過小達不到損傷的要求，偏大又會導致動物的死亡。單獨采用化療藥物造模常常需要花費較長一段時間才能造模成功［13］，并且由于不同藥物對各系血細胞的損傷程度不同，會造成某系的血細胞抑制而對其他系影響較小。且很多化療藥物使用后，機體會有一定的報復性反彈趨勢，可能對觀察藥物的作用造成影響，故本實驗采用復合造模法。

Fig 3 Peripheral blood counts

我們觀察到放化療結合抑制骨髓后2 d和7 d，骨髓抑制組動物的體重明顯減輕，精神萎靡，毛色失去光澤，骨質脆性增加，骨髓竇出血嚴重，骨髓細胞懸液呈較為明顯的紅色，與未進行骨髓抑制的動物相比有差異。骨髓抑制組動物的骨髓涂片顯示骨髓荒蕪一片，破壞嚴重，骨髓實質細胞大量減少。給予卡鉑和放療聯合處理后，發(fā)現動物有潛在出血傾向，外周血各系細胞下降明顯，紅細胞計數、血紅蛋白含量、血小板計數均在卡鉑和放療聯合處理后14d達到最低點，此后慢慢恢復，處理后28 d可基本恢復至正常水平。相比紅細胞計數和血紅蛋白含量，血小板計數恢復較為緩慢。外周血白細胞計數在卡鉑和放療聯合處理后7 d達到最低點，此后慢慢恢復，至處理后28 d可基本恢復到正常水平。實驗結果表明我們成功的用放化療結合的方法建立了骨髓抑制動物模型。且此動物模型具有操作簡單、骨髓抑制持續(xù)時間較長、死亡率較低的優(yōu)勢。

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